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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de l’inoculum bactérien uropathogène d’Escherichia coli (UPEC)
- Préparez l’inoculum des infections urinaires 89 (UTI89) (commencez 72 heures avant le jour de l’inoculation)
- Tracez UTI89 sur une plaque d’agar LB (Luria-Bertani) à partir d’une crosse congelée. Incubez toute la nuit à 37 °C. Choisissez une colonie et inoculez-la dans 10 ml de LB dans un flasque de 125 ml. Incubez à 37 °C pendant 24 heures, statiquement.
- Inoculez 10 μl de culture nocturne dans 10 ml de LB dans un nouveau flasque de 125 ml pour 24 heures supplémentaires à 37 °C, statiquement.
- Transférez 3 ml (cela varie selon la souche et la taille de l’inoculum souhaité) dans des tubes stériles de 1,5 ml, centrifugez à 7 000 x g pendant 3 minutes, puis resuspendez le pellet dans une solution SAV tamponnée phosphate (PBS) et centrifugez une seconde fois. Resuspendez le granule bactérien dans 1 mL 1x PBS.
- Mesurez la densité optique bactérienne et ajustez la concentration à la densité d’inocule souhaitée. La concentration standard de l’inoculum utilisé est de10,7 bactéries ; cependant, cela peut varier en fonction de la conception de l’étude.
2. Inoculation bactérienne
- Nettoyez la station de travail à 70 % d’éthanol et couvrez la zone de papier absorbant (ou utilisez une hotte à flux stérile).
- Extraire jusqu’à 0,9 ml de l’inoculum bactérien préparé dans une seringue de tuberculine (TB) de 1 ml (enlever les bulles d’air). Fixez une aiguille d’inoculation stérile préparée avec du polyéthylène d’une désignation de taille 10 (PE10) sur la seringue contenant l’inocule, puis découpez stérilement le tube en polyéthylène.
REMARQUE : Laissez 1 mm de tube au-dessus de la pointe de l’aiguille pour éviter de percer la vessie. - Coupez un morceau carré de parafilm de 1 pouce et mettez un peu de lubrifiant chirurgical (environ de la taille d’une pièce de dix cents) dessus.
- Anesthésiez les souris C3H/HeN femelles en les plaçant dans une chambre de vaporisateur (suivant le protocole du fabricant) jusqu’à ce qu’elles soient inconscientes mais respirent encore normalement (1 respiration/seconde).
ATTENTION : L’isoflurane est un anesthésique inhalatoire. À utiliser dans un endroit bien ventilé et à minimiser l’inhalation. - Retirez la souris du vaporisateur et posez-la sur le dos sur un essuie-tout en écartant les jambes.
- Couvrir le nez de la souris avec un cône nasal (un tube relié au vaporisateur qui fournit une dose contrôlée d’isoflurane fournie sur certains vaporisateurs) pour maintenir l’anesthésie.
- Palpez doucement la vessie pour provoquer la miction et assurer une vacuité. Essuyez la zone périurétrale avec une lingette à 100 % éthanol. Tamponnez l’aiguille/seringue d’inoculation, pointez d’abord dans le lubrifiant chirurgical.
- Inoculez chaque souris avec 50 μl de la solution bactérienne en insérant l’aiguille d’inoculation transurétralement, d’environ 12 mm, puis en appuyant doucement sur le ventoux de la seringue pour dispenser l’inoculum dans la vessie (10 μl/s). Retirez l’aiguille d’inoculation de la souris.
REMARQUE : Le retour immédiat de l’inoculum à l’ouverture urétrale lors du début de l’inoculation indique une insertion incorrecte ou incomplète de l’aiguille. - Retirez la souris du cône de nez et remettez-la dans sa cage. Répétez les étapes 2.3-2.8 pour chaque souris. Lorsque/si vous changez de condition ou de souche d’inocule, jetez la seringue et l’aiguille d’inoculation dans un récipient approuvé et recommencez à l’étape 2.2.
REMARQUE : L’inoculation avec des organismes uropathogènes ne provoque généralement pas de symptômes douloureux sévères. Cependant, dans de rares cas, l’administration de doses élevées d’agents pathogènes peut provoquer de la fièvre, une réduction de la consommation alimentaire et d’eau, ainsi qu’un comportement anormal. La santé animale doit être surveillée tout au long de l’expérience. Si des symptômes de douleur manifeste sont observés, un analgésique, tel que la buprénorphine (0,05−0,1 mg/kg administré par voie sous-cutanée), peut être appliqué.
3. Énumération des communautés bactériennes intracellulaires (CCI)
- Retirez aseptiquement la vessie et placez-la dans une PBS 1x dans une plaque à 6 puits avec un fond en silicone. Les plaques peuvent être préparées à l’aide d’un kit d’élastomère en silicone et en versant environ 1 cm de silicone dans chaque puits. Coupez la vessie en deux avec des ciseaux.
- À l’aide de petites goupilles métalliques, écartez doucement la vessie de façon à ce que la lumière de la vessie soit orientée vers le haut. Veillez à placer les goupilles aux bords les plus externes des sections de la vessie pour garantir que la quantité maximale d’urothélium soit exposée.
- Après l’écartage, lavez doucement la vessie une fois avec 1 PBS. Retirez le PBS 1x par pipette. Corrigez la vessie en ajoutant suffisamment de paraformaldéhyde à 3 % pour recouvrir toute la vessie écartée.
ATTENTION : Le paraformoldéhyde est cancérigène. Un équipement de protection approprié, y compris des gants, doit être porté en permanence. L’élimination doit suivre les directives institutionnelles. - Incubez à température ambiante pendant 1 heure. Retirez la solution de paraformaldéhyde. Laver une fois avec 1x PBS.
- Lavez avec la solution de lavage LacZ (2 mM deMgCl 2, 0,01 % de désoxycholate de sodium et 0,02 % de nonidet-p40 dans 1x PBS) trois fois pendant 5 minutes par lavage.
- Retirez la solution de lavage et ajoutez suffisamment de teinture LacZ (9,5 ml de solution de lavage LacZ, 0,4 ml de 25 mg/ml de galon X, et 0,1 ml de 100 mM de K-ferrocyanure/K-ferricyanure) pour couvrir les vessies. Incuber à 30 °C toute la nuit, protégé de la lumière.
- Retirez les vessies écartées de l’incubateur et observez les IBC, qui apparaissent comme des points bleus tels qu’ils sont visualisés avec une lunette de dissection, grossissement 40-60X.
REMARQUE : Parfois, une souris peut uriner avant la mise du tube sous l’urètre. Dans ce cas, attendez 15 à 20 minutes avant de tenter de prélever à nouveau l’urine.