Délivrance médiée par Agrobactérie de clones viraux recombinants dans les semis de maïs pour le silence génétique

Résumé

Source : Beernink, B. M. et al. Agroinoculation directe des semis de maïs par injection avec des clones infectieux du virus de la mosaïque de la queue de renard et du virus de la mosaïque de la canne à sucre. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre la délivrance médiée par Agrobacterium de clones viraux recombinants dans les semis de maïs pour la mise en silence génétique. Il décrit le processus d’infection à Agrobacterium , la propagation systémique du virus et les changements phénotypiques liés à l’interférence de l’ARN.

Protocole

1. Injection
REMARQUE : Les semis de maïs âgés de 4 à 7 jours peuvent être utilisés pour l’injection. Le taux de croissance des semis est fortement influencé par les conditions de croissance, la quantité de rayonnement photosynthétiquement actif (PAR) (c’est-à-dire un PAR plus élevé dans la serre que dans la chambre de croissance), et le génotype, entre autres éléments qui peuvent être difficiles à contrôler en conditions de serre. Les plantes peuvent être injectées dès l’âge de 4 jours, lorsqu’elles mesurent 2 à 3 cm de haut sans feuilles dilatées, et jusqu’à 7 jours lorsque la feuille arrondie la plus basse est étendue. Le taux de réussite de cette méthode d’inoculation diminue rapidement lorsque les plantes vieillissent au-delà de 7 jours après le semis. Le site d’injection est le même, quel que soit l’âge des semis.

1. Portant des lunettes de sécurité, injectez la suspension bactérienne dans les semis à 2-3 mm au-dessus du nœud coléoptilaire à l’aide d’une aiguille de 25G x 5/8" fixée à une seringue jetable de 1 mL.
   REMARQUE : Le nœud coléoptilaire est l’endroit où les racines du couronnement finiront par se former. C’est le nœud le plus bas de la centrale. En général, il y aura un changement de couleur du vert au blanc au niveau et en dessous du nœud. Le lieu d’injection est juste au-dessus du méristème. Disséquer quelques semis à ce stade peut aider à visualiser l’emplacement du méristem et, par conséquent, le site d’injection approprié.
2. Appliquez une pression douce sur la seringue jusqu’à ce que la suspension remplisse le coléoptile ou soit visible dans la spirale, selon le stade de croissance des plantes. Cela représente environ 100 à 200 μL de suspension.
   REMARQUE : S’il est difficile d’injecter la suspension dans le semis, le site d’injection peut être trop bas. Une pression modérée suffit pour injecter la suspension.
3. Injectez tous les semis, en changeant les seringues et les aiguilles pour chaque construction.

2. Entretien continu des plantes

1. Transplantez les semis injectés dans des pots de 13 x 13 x 15 cm ou plus lorsqu’ils auront 7 à 8 jours.
2. Maintenir les conditions de croissance (photopériode de 16 heures et fertilisation une fois par semaine).

3. Confirmation de l’infection (phénotypique)

1. Le score phénotypique obtient les plantes entre 14 et 21 jours après l’inoculation (DPI). Les lésions dues à la suppression des gènes témoins imitant la lésion 22 ou la phytoène désaturase peuvent facilement être observées sur les feuilles et sont distinctes des symptômes de FoMV.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringues de 1 mL	Fisher Scientific	14955450	alternativement, BD 309659
Souche d’Agrobacterium tumefaciens GV3101			Porte un plasmide de vir codant pour des machines de transfert d’ADN-T, RifR, GmR, issues de laboratoire
Engrais			Concentré d’engrais Peters 15-15-15
Grandes pots	Kordlok	SQL0550	5x5x4" ou plus. Pour la transplantation de semis.
Maïs Golden Bantam Graines de maïs doux	Prairies américaines, semences de la côte Ouest
Substrat du sol	SunGro Horticulture	SS#1-F1P	Mélange Sunshine #1/Fafard-1P, tout mélange de sol dans lequel le maïs pousse bien est suffisant