Établissement de biofilms bactérien-fongiques inter-règnes pour l’étude de la pathogenèse orale

Résumé

Source : Schlafer, S, et Frost Kristensen, M. Surveillance du pH extracellulaire dans des biofilms inter-royaumes à l’aide de la microscopie confocale. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre la culture de biofilms inter-règnes de Streptococcus mutans et Candida albicans dans des conditions de type oral pour modéliser les interactions bactériennes-fongiques, permettant d’étudier la synergie microbienne, l’adhésion médiée par le glucan et la virulence acidogénique dans la pathogenèse orale.

Protocole

Toutes les procédures concernant la collecte d’échantillons ont été réalisées conformément aux directives IRB de l’institut.

1. Culture de biofilms inter-royaumes

1. Cultivez Streptococcus mutans (S. mutans) DSM 20523 et Candida albicans (C. albicans) NCPF 3179 sur des plaques d’agar sanguin à 37 °C dans des conditions aérobies.
2. Transférez des colonies individuelles de chaque organisme dans des tubes à essai remplis de 5 mL d’infusion cérébrale (BHI). Cultivez pendant 18 heures dans des conditions aérobies à 37 °C.
3. Centrifugez les cultures toute la nuit à 1 200 x g pendant 5 minutes. Écartez le surnageant, resuspendez les cellules dans une solution physiologique et ajustez la OD_{de 550 nm} à 0,5 pour C. albicans (~10⁷ cellules/mL) et S. mutans (~10⁸ cellules/mL). Diluez la suspension de S. mutans 1:10 avec du sérum physiologique stérile (~10⁷ cellules/mL).
4. Pipettez 50 μL de solution salivaire stérile, dans les puits d’une plaque optique inférieure de 96 puits pour la microscopie. Incuber pendant 30 minutes à 37 °C. Laver les puits 3 fois avec 100 μL de solution physiologique stérile. Videz les puits.
5. Ajoutez 100 μL de suspension de C. albicans à chaque puits. Incubez à 37 °C pendant 90 minutes. Laver 3 fois avec du sérum physiologique stérile.
   REMARQUE : Ne videz pas complètement les puits pendant le lavage. Laissez un réservoir de 20 μL pour éviter des forces de cisaillement excessives.
6. Ajoutez 100 μL de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (inactivé à 56 °C pendant 30 minutes) dans chaque puits. Incubez à 37 °C pendant 2 heures. Laver 3 fois avec du sérum physiologique stérile. Videz les puits, laissant un réservoir de 20 μL.
7. Ajoutez 100 μL de suspension de S. mutans (préparé à l’étape 1.3) à chaque puits. Ajoutez 150 μL de BHI contenant 5 % de saccharose. Incubez à 37 °C pendant 24 heures ou plus. Lors de la culture de biofilms plus anciens, changez quotidiennement le substrat pour un BHI frais. À la fin de la phase de croissance du biofilm inter-règne, laver 5 fois avec du sérum physiologique stérile.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques d’agar sanguin	Statens Serum Institut	677
Perfusion cérébrale	Oxoïde	CM1135
Infusion cérébrale-cœur + 5 % de saccharose	Fournitures de laboratoire BDH	10274
Candida albicans	Collection nationale des champignons pathogènes	NCPF 3179
Sérum bovin fœtal	Technologies de Gibco Life	10270
Centrifugeuse réfrigérée GS-6R	Beckman	N/A
μ-Plate 96 Well Black	Ibidi	89626
Solution physiologique stérile	VWR	6404
Streptococcus mutans	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
Vis-spectrophotomètre V-3000PC	VWR	N/A