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1. Préparation de la plaquette de silicium
- Concevez les géométries du canal microfluidique dans un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO ; voir Table of Materials) et imprimez-les sur un film transparent pour créer le photomasque (Figure 1A).
- Fabriquez le moule maître par lithographie souple (en salle blanche) en suivant les étapes ci-dessous.
- Faites cuire la plaquette de silicium à 200 °C pendant 2 heures.
- Placez la plaquette au centre d’un spin-coater et versez du photorésine SU8 3050 (voir Tableau des matériaux) sur la plaquette. Spin coat à 1 700 tr/min pendant 40 secondes avec un temps de rampe de 10 s/100 tr/min.
REMARQUE : Les paramètres de revêtement de spin ont été réglés pour obtenir une épaisseur cible de 100 μm pour le SU8 3050. - Après le processus de spin-coating, faites cuire doucement la plaquette de silicium à 65 °C pendant 600 s et à 95 °C pendant 2 700 s. Laissez la plaquette refroidir à température ambiante toute la nuit.
REMARQUE : Le refroidissement nocturne améliore l’adhérence du SU8 à la plaquette. - Placez le photomasque (étape 1.1) sur la plaquette et exposez-la à la lumière UV, avec une énergie d’exposition de 250 mJ/cm² et une longueur d’onde de 350 nm.
- Après exposition, cuire le substrat exposé à 65 °C pendant 60 secondes et 95 °C pendant 300 secondes.
- Développer la plaquette en silicium pour obtenir le moule maître en l’immergeant dans un bécher rempli de révélateur mrDev600 (voir Tableau des matériaux). Secouez doucement le bécher pendant 1 800 s pour éliminer la résistance non polymérisée. Ensuite, faites un lavage éclaboussé en vaporisant de l’isopropanol sur la plaquette de silicium et faites sécher à l’air libre.
- Faites cuire durement la plaquette de silicium à 200 °C pendant 1 800 s.
- Silaniser le moule maître par dépôt en vapeur de 20 μL de silane Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) (voir Tableau des matériaux) placé sur une lame en verre à côté du moule pendant 40 minutes dans un dessiccateur sous vide, créant une pression manométrique de 100 mbar.
2. Fabrication du dispositif microfluidique
REMARQUE : La procédure de fabrication décrite ici concerne un dispositif microfluidique avec un canal microfluidique. Cependant, la même méthode peut être appliquée pour fabriquer un dispositif microfluidique avec plusieurs canaux microfluidiques en parallèle.
- Mélangez l’élastomère avec son réticulateur à un ratio de 10:1 (voir Tableau des matériaux) pour préparer un mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS). Remuez le mélange jusqu’à ce qu’il soit uniformément mélangé et devienne opaque à cause des bulles d’air enfermées.
- Dégazez le mélange dans un dessicateur sous vide, créant une pression manométrique de 100 mbar jusqu’à ce que les bulles d’air emprisonnées soient retirées et qu’il paraisse transparent. Le temps nécessaire pour le dégazage est généralement de 30 minutes.
- Placez le moule maître (étape 1) dans un plat de culture cellulaire (voir Tableau des matériaux). Verser 20 g de mélange PDMS sur le moule maître pour obtenir des canaux d’une épaisseur finale de 5 mm.
- Faites cuire le moule maître à 70 °C pendant 2 heures.
- Découpez le PDMS durci autour du canal microfluidique (à une distance d’environ 3 mm) à l’aide d’une lame, puis décollez le canal microfluidique PDMS du moule maître.
- Pour créer l’entrée et la sortie des canaux microfluidiques, percez des trous avec une poinçonne de biopsie (diamètre de 1,5 mm) à leurs extrémités (haut des triangles, voir Figure 1A). Percez un trou supplémentaire au centre du triangle d’entrée pour installer le capteur de pression plus tard.
- Lavez une lame en verre et le canal microfluidique avec une solution détergente commerciale à 1 % (voir Tableau des matériaux) pendant 5 minutes, puis rincez-les à l’eau déionisée. Ensuite, lavez le canal microfluidique du PDMS et la lame en verre avec de l’isopropanol. Ensuite, rincez-les à nouveau avec de l’eau déionisée. Séchez le canal microfluidique du PDMS et la lame en verre avec de l’air comprimé à 1 bar pendant 1 minute.
REMARQUE : La structure poreuse du PDMS doit être complètement sèche pour que la liaison soit efficace. - Placez la lame en verre et le canal microfluidique dans un nettoyant plasma (voir Tableau des matériaux) et assurez-vous que les surfaces à coller sont orientées vers le haut. Allumez le nettoyant plasma et traitez le canal microfluidique et la lame en verre avec du plasma d’air à un débit d’air de 1 SL/h (litre standard par heure) pendant 1 minute. Fixez le canal microfluidique à la lame en verre immédiatement après les avoir sortis du nettoyant en les mettant en contact l’un avec l’autre.
REMARQUE : Veillez à ne pas toucher les surfaces traitées, car cela pourrait affecter la collation. Lors de la fabrication d’un dispositif microfluidique avec plusieurs canaux microfluidiques, exposez les canaux microfluidiques simultanément et liez-les en une seule étape. - Placez le dispositif microfluidique lié sur une plaque chauffante à 80 °C pendant au moins 15 minutes.
- Conservez l’appareil microfluidique dans une cuvette de culture cellulaire propre jusqu’au début de l’expérience.
3. Préparation de la suspension bactérienne
- Cultivez une population de Bacillus subtilis NCIB 3610 pendant 20 h avant le début de l’expérience en inoculant directement 3 mL de milieu de culture pour bouillon nutritif n° 3 (voir Tableau des matériaux) à partir d’un stock de glycérol congelé dans un tube de culture de 15 mL. Incubez dans un incubateur secouant à 30 °C et 200 tr/min pendant la nuit (pendant 16 heures).
- Préparez une sous-culture à partir de la culture nocturne 4 heures avant le début de l’expérience en ajoutant 3 μL de culture nocturne dans 3 mL de milieu de culture frais (dilution 1:1 000) dans un tube de culture de 15 mL. Incubez la sous-culture dans un incubateur secouant à 30 °C à 200 tr/min pendant 3,5 à 4 heures pour obtenir une densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) de 0,1.
4. Expérience de croissance de biofilms
- Allumez l’incubateur en boîte du microscope 3 h avant l’expérience pour garantir une température stable de 25 °C. Montez la pompe à seringue et les capteurs de pression (voir Tableau des matériaux).
- Connectez les tubes d’entrée et de sortie au dispositif microfluidique. Insérez directement une aiguille (d’un diamètre extérieur de 0,6 mm) dans le tube d’entrée pour sécuriser la connexion entre le tube et la seringue.
- Placez le dispositif microfluidique, 30 mL d’eau déionisée et 30 mL de milieu de culture dans un dessicateur sous vide et dégazez-les pendant au moins 1 heure. Ensuite, tirez lentement le milieu de culture et l’eau déionisée dans deux seringues séparées de 30 mL.
REMARQUE : Cette étape est cruciale pour éviter la formation de bulles dans le canal lors du rinçage avec le milieu de culture. - Montez l’appareil microfluidique sur le microscope et placez le tube de sortie dans un contenant à déchets.
- Connectez la seringue remplie d’eau déionisée au canal microfluidique via le tube microfluidique et injectez lentement l’eau jusqu’à ce qu’elle sorte par la sortie du capteur de pression. Remplissez le capteur de pression d’eau et rincez toutes les bulles du tube reliant le canal microfluidique au capteur de pression. Fermez la sortie du capteur de pression avec les vis dédiées au capteur de pression.
REMARQUE : La procédure de remplissage décrite garantit que les variations de pression à l’entrée des canaux microfluidiques seront enregistrées avec précision. Lors d’une expérience avec plusieurs canaux microfluidiques, connectez chaque canal à une seringue distincte pour garantir des conditions de flux égales dans tous les canaux.
- Remplissez le reste du canal microfluidique avec l’eau déionisée.
- Placez un filtre de 1,2 μm (voir le tableau des matériaux) sur la seringue du milieu de culture. Ensuite, retirez la seringue à eau et connectez soigneusement la seringue du milieu de culture au tube microfluidique d’entrée. Montez la seringue sur la pompe et rincez le canal avec le milieu de culture à un débit de 2 mL/h pendant 1 heure.
REMARQUE : Le filtre empêche les cellules bactériennes d’entrer dans la seringue lors du chargement. Le rinçage du canal microfluidique avec le milieu de culture éliminera les bulles restantes dans la structure poreuse. - Réglez la pompe à seringue au débit désiré (ici 1 mL/h) pendant l’expérience et réglez la lecture de pression des capteurs de pression à zéro.
REMARQUE : En réglant la lecture de pression initiale à zéro, seule la différence de pression causée par le développement du biofilm pendant l’expérience sera mesurée. - Pipeter 1 mL de la culture bactérienne à un OD₆₀₀ de 0,1 dans un flacon centrifugeuse de 1,5 mL. Chargez la culture bactérienne dans le canal microfluidique en plaçant le tube de sortie dans le flacon de la centrifugeuse. Après avoir attendu 5 minutes pour éliminer toute bulle d’air potentielle de la sortie des tubes, on prélève 150 μL de solution bactérienne à un débit de 1 mL/h, jusqu’à ce que le canal microfluidique soit rempli par la culture bactérienne.
- Retirez soigneusement le filtre à seringue du média de culture et placez la sortie dans le contenant à déchets. Laissez les cellules bactériennes à flux nul dans le canal microfluidique pendant 3 heures afin de permettre leur attache de surface dans le milieu poreux.
REMARQUE : Laisser les cellules bactériennes dans des conditions de débit nul pendant 3 heures a été optimisé pour l’attachement de la souche bactérienne utilisée tout en assurant une culture bactérienne bien oxygénée. D’autres souches bactériennes peuvent nécessiter plus ou moins de temps. - Pour commencer l’expérience, lancez le débit en réglant la pompe à seringue au débit désiré (ici 1 mL/h) et en commençant la lecture de pression à 1 Hz.
- Acquérir des images du biofilm en croissance à l’intervalle de temps désiré, à la configuration optique et au grossissement.
REMARQUE : Dans la présente étude, des images à un grossissement 4x en mode champ clair dans 18 positions couvrant tout le domaine du milieu poreux ont été acquises toutes les 6 minutes pendant 24 heures.
