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1. Inoculation des bactéries
- Déterminer le nombre de bactéries à inoculer en fonction de la mesure à utiliser pour déterminer l’adhésion bactérienne et la durée du temps d’incubation.
- Pour les études microscopiques impliquant des temps d’incubation inférieurs à 1 jour, inoculez un nombre relativement important de bactéries. Ajoutez une quantité de culture pour atteindre une concentration bactérienne finale supérieure à 106 bactéries par mL. Pour des temps d’incubation plus longs, réduisez la taille de l’inoculum bactérien.
- Pour les études où l’adhésion bactérienne sera mesurée par le nombre de cellules viables, ajoutez une quantité de culture pour atteindre une concentration bactérienne finale de 103 à 106 bactéries par mL.
- Évitez d’ajouter trop de bactéries que leur métabolisme modifie le pH ou la concentration d’oxygène dans le milieu d’incubation. Mesurez le pH à l’aide de papier pH ou d’une électrode. Mesurez la concentration d’oxygène à l’aide d’une électrode d’oxygène.
- Pour les plantes cultivées dans le sable, vaccinez de trois manières possibles.
- Inoculez les graines avec les bactéries avant de les planter en les faisant tremper pendant 1 minute dans une suspension dans de l’eau d’environ 10à 6 bactéries par mL.
- Inoculez la racine en faisant germer des semis axéniques. Lorsque la racine du semis mesure environ 1 cm de long, trempez-la ou placez le plant entier dans une suspension de 10à 6 bactéries par mL dans l’eau pendant 1 minute.
- Inoculez le sable en mélangeant les bactéries au sable avant la plantation pour obtenir une concentration finale d’environ 103 bactéries par mL ou en arrosant le plant avec une suspension de 106 bactéries par mL après la plantation.
2. Incubation des bactéries avec le matériel végétal
- Pour l’incubation dans un milieu liquide, incubez les bactéries avec le matériau végétal dans de l’eau stérile ou du saccharose, ainsi que des sels minéraux ou un milieu de culture végétale (comme une dilution 1:10 du mélange de sels basaux Murashige et Skoog ou de sels MS).
- Utilisez un récipient auquel les bactéries ne s’accrochent pas. Essayez de garder la surface de la plante couverte en continu, soit par immersion, soit par une légère agitation. Une agitation vigoureuse peut empêcher l’adhésion ou même éliminer les bactéries de la surface de la plante.
- Observez le matériel végétal au microscope optique après des intervalles de temps variables pour déterminer quand arrêter l’incubation et effectuer des mesures. Un processus d’adhérence temporel est souvent précieux avec des échantillons prélevés toutes les 1 à 4 heures ou tous les jours, selon la vitesse de l’interaction.
- Pour incuber dans le sable, appliquez les mêmes considérations décrites pour l’incubation dans un milieu liquide à l’étape 2.1.
3. Mesure de l’adhésion à l’aide de la microscopie
- Effectuer des mesures microscopiques avec Nomarski ou des optiques à contraste de phase pour une vue facile des bactéries sur les surfaces. Cependant, tout microscope en champ clair avec un grossissement de 20X ou plus peut être utilisé.
- Utilisez l’observation microscopique pour déterminer si les bactéries sont réparties de manière aléatoire ou situées à des sites spécifiques. Vérifiez aussi s’ils sont liés individuellement ou en grappes. Cherchez la présence de microcolonies suggérant une croissance bactérienne ou un emprisonnement après l’adhésion. Vérifiez si les bactéries semblent former un biofilm à la surface.
REMARQUE : Un biofilm est un grand nombre de bactéries liées à la surface et entourées d’une matrice extracellulaire. La structure peut être lisse et uniforme ou présenter une architecture plus complexe. - Utilisez des bactéries marquées avec un marqueur fluorescent. Si d’autres bactéries sont présentes et que les bactéries d’intérêt sont identifiées par une étiquette fluorescente telle que la protéine fluorescente verte (GFP), utilisez la microscopie à fluorescence pour déterminer la présence des bactéries marquées dans des grappes d’autres bactéries. Pour la GFP, utilisez un filtre avec 490 nm d’excitation et 520 nm d’émission.
- Vérifiez que le marquant fluorescent n’affecte pas négativement les bactéries en observant l’adhésion au matériau axénique d’un mélange égal de bactéries de type sauvage et de bactéries marquées de la même souche en utilisant à la fois l’optique Nomarski et l’optique à fluorescence. Si les bactéries fluorescentes et sombres sont mélangées de manière aléatoire et présentes en nombre égal, alors la marque n’a pas interféré avec le test.
- Déterminez le nombre de bactéries attachées.
REMARQUE : Il est très difficile de déterminer le nombre de bactéries attachées au microscope. Lorsque la liaison est sur des surfaces végétales irrégulières, il n’est généralement pas possible d’obtenir une mesure quantitative. La microscopie électronique à balayage (non abordée dans cet article) peut être utilisée pour effectuer de telles mesures.- Lorsque les bactéries sont liées à une surface lisse, comme un poil racinaire, comptez le nombre de bactéries liées au bord du poil racinaire par mm de longueur. Veillez à utiliser des poils racinaires d’une taille et de forme similaires pour comparer les mesures.
- Pour déterminer la taille des objets au microscope, utilisez une lame commerciale avec des marquages mesurés dessus. Observez et photographiez cette diapositive aux mêmes réglages que ceux utilisés pour le matériel expérimental et utilisez les images obtenues pour déterminer la taille des objets dans les photomicrographies.
- Préparez l’échantillon pour la microscopie.
- Lavez l’échantillon. Déplacez l’échantillon sur une goutte d’eau ou un milieu d’incubation sur une lame de microscope et observez-le directement.
REMARQUE : Cela a l’avantage que s’il n’y a pas de croissance bactérienne ou de mort bactérienne réelle, il est peu probable qu’il y ait beaucoup de bactéries libres. Prenez l’absence de bactéries libres comme un signe d’alerte indiquant qu’il pourrait y avoir eu une mort bactérienne ou une liaison bactérienne au contenant dans lequel l’incubation a eu lieu. L’effet du lavage de l’échantillon est illustré à la Figure 1. - Lavez doucement l’échantillon dans de l’eau ou un milieu d’incubation en le plaçant dans un flacon de liquide et en inversant doucement le flacon. Ensuite, placez l’échantillon sur la lame du microscope dans un liquide frais pour observation.
- Montez l’échantillon dans un liquide à l’aide d’une bande de couverture ordinaire et d’une lame de microscope.
- Si l’échantillon est épais et qu’il faudrait donc faire une bosse sous la barre de couvercle, utilisez une engobe de couverture à application presse. Ces barbons de couverture comportent un anneau en caoutchouc ou en plastique autour du bord de la gaine de couverture. Placez le liquide et l’échantillon dans le puits de la barbe de couvercle, puis placez la lame sur le dessus et appuyez doucement pour sceller la barbe de couvercle à la lambe. Inversez et examinez.
- Sinon, utilisez une glissière et une couverture pour comptage les algues de manière similaire. Notez que les lames avec cette profondeur ne peuvent généralement pas être examinées avec une lentille objective de plus de 20X.
