Formation des granules de stress lors de l’infection à Shigella des cellules épithéliales cancéreuses

Résumé

Source : Vonaesch, P. et al., Analyse immunofluorescence de la formation de granules de stress après un défi bactérien sur les cellules de mammifères. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre l’infection des cellules épithéliales par la bactérie pathogène Shigella flexneri et la réponse cellulaire de l’hôte qui en résulte. Les protéines effectrices bactériennes perturbent la traduction de l’hôte, déclenchant la formation d’organites sans membrane appelés granules de stress, qui reflètent la réponse adaptative de la cellule à l’infection.

Protocole

1. Préparation des bactéries et des cellules hôtes

1. Transférez des couvercles en verre de 12 ou 14 mm en plaques de 24 ou 12 puits respectivement, avec une pince à épiler stérile, en comptant un puits par condition expérimentale. Stérilisez-les par traitement ultraviolet (UV) dans une hotte de culture tissulaire pendant 15 minutes.
   REMARQUE : Inclure des puits de contrôle pour le défi bactérien et pour l’induction des granules de stress (SG) par des contraintes exogènes.
2. Pour une plaque à 24 puits avec des glappes de 12 mm, semez 1 x 10 5^{cellules de} mammifères (par exemple, des cellules HeLa) sur des glappes de couverture ; Appuyez sur les habilles avec une pointe de pipette stérile. Laissez les cellules adhérer toute la nuit à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire à 5 % de_CO-2 , dans un milieu de culture adapté à chaque type cellulaire.
   REMARQUE : Cellules en plaque de sorte que la confluence des cellules se situe entre 40 et 60 % le lendemain.
   1. Pour les cellules HeLa, incubez dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec des acides aminés non essentiels (NEAA) et un sérum fœtal de veau décomplémenté à 10 % (FCS). Réduisez le FCS en chauffant pendant 30 minutes dans un bain-marie à 56 °C, en faisant tourner le sérum une fois après 15 minutes.
3. Pour éliminer les bactéries, utilisez une pointe de pipette stérile pour retirer une petite quantité d’un stock de glycérol bactérien (20 % de glycérol) conservé dans un congélateur à -80 °C et placez-la sur une assiette marquée. Utilisez une boucle stérile pour répartir les bactéries sur environ 10 % de la plaque. Utilisez une nouvelle boucle stérile et faites-la glisser à travers la bâche pour former 3 lignes parallèles, d’une demi-plaque de long. Traversez ces lignes, couvrant le reste de la plaque. Incubez la plaque O/N à 37 °C.
   1. Sélectionnez une seule colonie bactérienne (par exemple, Shigella flexneri) sur la plaque fraîchement striée. Évitez de travailler avec des colonies bactériennes âgées de plus d’une semaine.
   2. Pour la souche M90T de S. flexneri , inoculez une colonie rouge d’un agar triptique de soja fraîchement rayé, une plaque d’agar rouge Congo à 0,1 % dans 8 mL de bouillon de soja tryptique dans un tube de 15 mL ; Serrez le couvercle et incubez en secouant à 222 tr/min O/N à 30 °C. ATTENTION : N’utilisez pas de grandes colonies blanches car elles ont perdu le plasmide de virulence et ne sont pas infectieuses.

2. Défi bactérien des cellules hôtes

1. Préparez les bactéries pour maximiser le potentiel d’infection.
   1. Pour S. flexneri, sous-cultivez les bactéries en ajoutant 150 μL de culture O/N à 8 mL d’agar tryptique de soja et incubez les secouements à 222 tr/min à 37 °C jusqu’à la phase exponentielle tardive (~2 h) afin d’induire l’expression des gènes de virulence et d’augmenter l’infection.
      1. Lorsque la culture est à une densité optique comprise entre 0,6 et 0,9 (mesurée à 600 nm), transférez 1 mL de culture dans un tube de 1,5 mL. Granuler les bactéries pendant 2 minutes à 8 000 x g puis les resuspendre dans le milieu infectieux (DMEM avec NEAA, sans FCS) à un OD₆₀₀ = 1. Ainsi, si le OD₆₀₀ est de 0,85, resuspendez à 850 μL.
         REMARQUE : Pour S. flexneri, à un OD₆₀₀ = 1, il y aura^{8 x} 10 8 bactéries par mL lors de la culture dans un milieu de 8 mL. Une multiplicité d’infections (MOI) de 20 est appropriée. Pour les autres agents pathogènes, le nombre de bactéries par mL à un OD₆₀₀ et le MOI approprié doivent être déterminés empiriquement.
   2. Pour renforcer les interactions bactériennes-hôtes, recouvrez les bactéries de poly-L-Lysine (PLL).
      REMARQUE : Le traitement par PLL de S. flexneri n’a eu aucun effet sur la dynamique des SG. D’autres agents pathogènes doivent être évalués pour évaluer leur aptitude au traitement de la PLL.
      1. Pour recouvrir les bactéries de PLL, centrifugez 1 mL de culture bactérienne pendant 2 minutes à 8 000 g puis remettez la granule en suspension dans 10 μg/mL de PLL dans une solution sérigène tamponnée phosphate (PBS) à un OD₆₀₀ = 1.
      2. Ajoutez la solution bactérienne dans un petit plat, comme un puits dans une plaque à 12 puits, puis incubez à RT (~ 20 °C) pendant 10 minutes en agitant doucement sur un shaker à assiettes.
      3. Pelletez les bactéries pendant 2 minutes à 8 000 x g, en retirant l’excès de PLL. Reposez le pellet dans 1 mL de PBS et répétez cette étape de lavage deux fois. Après le lavage final, reposez dans le milieu infectieux à un OD₆₀₀ = 1.
         REMARQUE : Ici, le milieu d’infection pour S. flexneri est un milieu cellulaire hôte contenant 20 mM de N-(2-hydroxyétyl)piperazine-N'-(acide 2-éthanassulfonique) (HEPES) sans FCS.
2. Préparez les cellules au défi bactérien.
   1. Retirez le milieu des cellules HeLa des mammifères à l’aide d’une pompe d’aspiration. Ajouter 500 μL de milieu cellulaire RT HeLa pour laver les cellules, faire tourner, retirer le milieu à l’aide d’une pompe d’aspiration, puis remplacer par un milieu d’infection adapté à température ambiante (RT) de 500 μL (par exemple, un milieu cellulaire hôte avec 20 mM HEPES sans FCS).
   2. REMARQUE : Pour toutes les étapes de lavage, travaillez rapidement et ne traitez que jusqu’à 4 couches de couverture à la fois pour éviter que les cellules ne sèchent.
3. Challenge a préparé les cellules HeLa avec des bactéries pour infecter 20 à 50 % des cellules.
   REMARQUE : Le moment approprié et le MOI doivent être déterminés pour chaque espèce bactérienne. En général, un bon départ est de 30 minutes à 37 °C avec un MOI de 10.
   1. Pour S. flexneri, défiez les cellules HeLa en utilisant l’une des deux méthodes (étape 2.3.1.1 ou 2.3.1.2).
      1. Faire tourner des bactéries non traitées à PLL (20 μL de₆₀₀ de l’OD = 1/puits de plaque à 24 puits dans un milieu de 500 μL) sur des cellules pendant 10 minutes à 13000 x g.
      2. Ajoutez des bactéries enrobées de PLL (15 μL de₆₀₀ OD = 1/puits de plaque à 24 puits dans un milieu de 500 μL) pendant 15 minutes à RT pour permettre aux bactéries de se déposer sur les cellules.
   2. Laissez l’infection se produire en plaçant les cellules contenant des bactéries déposées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 30 minutes.
      REMARQUE : Pour des moments de courte durée, synchronisez l’infection à S. flexneri en plaçant les plaques dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 minutes au lieu de les placer dans l’incubateur de culture tissulaire.
4. Arrêter l’infection en lavant les cellules.
   1. Pour laver les cellules et éliminer l’excès de bactéries, retirez le milieu à l’aide d’une pompe à aspiration, ajoutez 1 mL de milieu de culture HeLa frais préchauffé (37 °C) (DMEM, 10 % FCS, NEAA). Faites tourner le médium, retirez et remplacez-le par un substrat frais. Répétez deux fois et laissez un nouveau milieu sur les cellules.
      1. Pour S. flexneri ou d’autres bactéries intracellulaires, après infection des cellules HeLa et des lavages, on remplace le milieu par un milieu de culture standard contenant 50 μg/mL de gentamicine afin de tuer les bactéries extracellulaires et d’empêcher toute invasion cellulaire.
         REMARQUE : N’ajoutez pas d’antibiotiques au milieu pour les bactéries extracellulaires.
5. Incubez les bactéries avec des cellules pendant la durée souhaitée dans un incubateur de culture tissulaire.
   REMARQUE : Pour S. flexneri, l’infection peut durer jusqu’à 6 heures, selon le type cellulaire. Pour les cellules HeLa, laissez l’infection se poursuivre pendant 1,5 à 2 heures avant d’ajouter des contraintes exogènes pour induire la formation du SG. Pour les infections à Caco-2, où Shigella se propage de cellule en cellule, infectez pendant 30 minutes à 6 heures avant d’ajouter un stress exogène. Les cellules peuvent être fixées à ce stade sans ajouter de stress exogène pour évaluer la formation des SG à la suite de l’infection bactérienne.

3. Fixation et analyse immunofluorescence de la formation des granules de contrainte

REMARQUE : Traiter simultanément les couvre-vêtements témoins et expérimentaux afin d’éviter les différences de coloration qui pourraient affecter l’analyse de l’image aux étapes suivantes. Les échantillons témoins incluent l’absence d’infection avec ou sans traitement inducteur de la SG, et des échantillons infectés avec ou sans traitement induisant la SG.

1. Retirez complètement le milieu à l’aide d’une pompe d’aspiration et fixez les échantillons en ajoutant 0,5 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % de RT dans le PBS. Incuber pendant 30 minutes en temps de repos.
   ATTENTION : La PFA est nocive pour le manipulateur et l’environnement. Prenez les mesures appropriées pour protéger le manipulateur et éliminer les déchets chimiques.
   REMARQUE : Sinon, fixez pendant 15 minutes puis remplacez par un méthanol prérefroidi à -20 °C pendant 10 minutes pour conserver une localisation cytoplasmique plus importante des marqueurs SG.
2. Retirez le PFA avec une pipette et jetez le liquide dans un contenant approprié pour déchets. Lavez la couche de couverture avec 1 mL de solution saline tris-tamponnée (TBS : 25 mM Tris, pH 7,3 ; 15 mM chlorure de sodium, NaCl). Faites couver la housse pendant 2 minutes en secouant doucement sur un shaker d’assiette pendant le lavage.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Shigella flexneri			Disponible sur demande auprès de divers laboratoires
Bouillon de soja à la caséine tryptone (TCS)	BD Biosciences	211825	Milieu de croissance standard pour Shigella, application - croissance bactérienne
Agar TCS	BD Biosciences	236950	Agar de croissance standard pour Shigella, application - croissance bactérienne
Rouge du Congo	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Outil de discrimination pour Shigella qui a perdu le plasmide de virulence, application - croissance bactérienne
Poly-L-Lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P1274	Utile pour revêtir les bactéries afin d’augmenter l’infection, application - infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Élimination sélective des bactéries extracellulaires mais non cytosoliques, application - infection
HEPES	Technologies de vie	15630-056	Le tampon pH est utile lorsque les cellules sont incubées à RT, application : culture cellulaire
Eagle medium modifié (DMEM) de Dulbecco	Technologies de vie	31885	Milieu de culture standard pour les cellules HeLa, application - culture cellulaire
Sérum fœtal pour veaux (FCS)	Biowest	S1810-100	Supplémentation à 5 % utilisée pour le milieu de culture cellulaire HeLa, application - culture cellulaire
Acides aminés non essentiels (NEAA)	Technologies de vie	11140	dilution 1:100 utilisée pour le milieu de culture cellulaire HeLa, application - culture cellulaire
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Diluant réactif, application - culture cellulaire
Paraformoldéhyde (PFA)	Scènes de microscopie électronique	15714	Le PFA à 4 % est utilisé pour la fixation standard des cellules, application - fixation
Plaque de culture cellulaire à 24 puits	Sigma-Aldrich	CLS3527	Plaques standard de culture tissulaire, application - culture cellulaire
Goubles de revêtement en verre de 12 mm	NeuVitro	1001/12	Soutien en culture cellulaire pour applications immunofluorescentes, application - support cellulaire
Pinces	Sigma-Aldrich	81381	Milieu de montage bon marché et robuste qui fonctionne bien pour la plupart des fluorophores, application - montage