Imagerie par fluorescence de la colonisation bactérienne dans le tissu rénal de la souris

Résumé

Source : Behera, R. K., et al. Une méthode basée sur la fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre une méthode de préparation du tissu rénal infecté de souris, de coloration de l’ADN et de détection de l’expression génique bactérienne à l’aide de doubles rapporteurs fluorescents. Le rouge marque toutes les bactéries, et le vert met en avant les cellules sensibles à l’infection.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Prélèvement des organes et traitement des tissus
   1. Euthanasiez les animaux par inhalation de CO₂ et luxation cervicale comme méthode secondaire, puis réalisez une nécropsie.
   2. Prélever le rein (à droite) et d’autres organes vitaux (cœur, foie, poumons, rate) et transférer dans des tubes de polypropylène de 15 mL contenant 10 % [v/v] de formol tamponné.
   3. Laissez les organes se fixer dans l’obscurité à température ambiante avec un léger secouement ou une rotation pendant au moins 24 heures, mais pas plus de 48 heures.
   4. Insérez les organes dans un milieu de congélation tissulaire clair et stockez les tissus à -80 °C.
   5. À l’aide d’un cryostat, coupez le tissu en tranches de 10 μm d’épaisseur.
   6. Séchez les sections sur une lame en verre pré-nettoyée et chargée pendant 20 minutes dans le noir. Appliquez un support de montage dur avec une teinture 4'6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et une gaine de protection. Les lames montées à température ambiante pendant la nuit et transférées à 4 °C pour un stockage à long terme.
2. Microscopie confocale à balayage laser et traitement d’image
   1. Examinez les lames montées pour localiser les lésions à l’aide de lasers adaptés au reporter fluorescent utilisé. Dans ce cas, les signaux de fluorescence vert (GFP ou protéine fluorescente verte), rouge (tdTomato) et bleu (DAPI) sont utilisés.
   2. Acquérez l’image en utilisant l’objectif approprié pour visualiser les cellules individuelles (par exemple, généralement des objectifs de 20x ou 40x).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C57Bl/6 souris	Rivière Charles	NA
Microscope laser confocal à balayage	Zeiss	NA
Microtome cryostat	Thermo Scientific	NA
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Homogénéiseur de Precellys 24	Laboratoires Bertin	NA
Substrat de congélation pour tissus clairs Sub Xero	Mercedes Medical	MER5000
Lames de microscope Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Vectashield Medium de montage antifade avec DAPI	Laboratoires Vector	H-1500