Imagerie des changements morphologiques chez les bactéries à l’aide de la microscopie à fluorescence à cellules vivantes

Abstract

Source : Brzozowski, R. S. et al. Microscopie à fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements morphologiques cellulaires chez les bactéries. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre la microscopie à fluorescence à cellules vivantes pour visualiser les changements morphologiques en temps réel chez les bactéries. Il décrit les étapes impliquées dans l’imagerie, l’acquisition en accéléré et la déconvolution pour obtenir des images haute résolution en temps réel.

Protocol

1. Imagerie

1. Le jour de l’expérience, allumez le système de microscope. Démarrez le logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux) en cliquant sur l’icône appropriée sur le bureau. Initialisez le microscope en cliquant sur l’option Initialiser le microscope (le bouton est représenté avec un microscope dessus) dans la boîte de dialogue de démarrage du logiciel. Assurez-vous que l’objectif est complètement abaissé à l’aide du réglage grossier du microscope avant l’initialisation.
   REMARQUE : Après l’initialisation, trois boîtes de dialogue supplémentaires devraient apparaître en plus du menu démarrer : resolve3D, collecte de données et surveillance du filtre.
2. Placez une goutte d’huile de 1,517 (indice de réfraction) sur l’objectif d’immersion en huile 100x fourni par le fabricant (Ouverture numérique = 1,4, Distance de travail = 0,12 mm ; voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE : Il est important de choisir l’huile d’immersion appropriée pour la température à laquelle l’imagerie est réalisée.
3. Chargez le plat en verre contenant l’échantillon dans le boîtier métallique (cercueil) et glissez-le doucement dans la pince de l’étage.
4. Utilisez le bouton de réglage grossier pour relever l’objectif jusqu’à ce que l’huile touche le fond en verre du plat. Utilisez l’oculaire et le bouton de réglage fin pour mettre l’échantillon au point. Une fois les cellules nettes, tournez le bouton de l’oculaire en mode caméra en déplaçant le sélecteur situé à l’avant du corps du microscope vers la gauche.
5. Commencez l’expérience avec le logiciel d’imagerie. Sur la fenêtre Resolve3D , sélectionnez l’icône Concevoir/exécuter l’expérience représentée par une flasque. Une nouvelle boîte de dialogue devrait apparaître intitulée concevoir/exécuter l’expérience.
   1. Définissez le nombre de piles Z et l’épaisseur de l’échantillon à l’aide de l’onglet design puis section dans la boîte de dialogue conception/exécution de l’expérience .
      REMARQUE : Pour les expériences de la section des résultats représentatifs, 17 Z-stacks à un intervalle de 200 nm pour les images fixes et quatre Z-stacks à 200 nm pour la microscopie en accéléré temporel ont été utilisés.
   2. Pour mesurer l’épaisseur des cellules de l’échantillon, ajustez manuellement le plan Z de manière incrémentale en utilisant les flèches haut et bas de la boîte de dialogue resolve3D . Marquez où les cellules sont floues comme les limites supérieures et inférieures pour l’acquisition d’images. Importez ces informations avant de lancer l’expérience.
   3. Pour aider à minimiser la phototoxicité et le photoblanchiment lors de l’imagerie en accéléré, réduisez le nombre de piles Z et choisissez le plan médian des cellules pour l’acquisition de l’image.
6. Sélectionnez le jeu de filtres approprié pour l’expérience à l’aide de l’onglet design puis channels dans la boîte de dialogue design/exécution de l’expérience (TRITC : EX 542/27 ; EM 597/45 ; FITC/GFP : EX 475/28 ; EM 525/48 ; mCherry : EX 575/25 ; EM 632/60 ; Cy5 : EX 632/22 ; EM 676/34).
   1. De plus, sélectionnez une référence pour la collecte des informations POL/DIC. Ajustez le pourcentage de transmission (intensité lumineuse) et la durée d’exposition pour chaque canal sélectionné avant l’imagerie en sélectionnant les options appropriées dans la boîte de dialogue resolve3D .
      REMARQUE : Dans un champ de vision de test qui n’est pas pris en compte pour l’expérience, testez ces réglages pour déterminer si les paramètres sélectionnés obtiennent des données de fluorescence significatives sans manquer un signal faible ni le sursaturer. Ensuite, importez ces paramètres pour la configuration expérimentale.
7. Ouvrez la liste des points en sélectionnant le bouton Liste des points dans la boîte de dialogue resolve3D . Une nouvelle boîte de dialogue devrait apparaître intitulée liste des points. Marquez plusieurs champs de vision à utiliser dans l’expérience en trouvant les champs de vision appropriés à l’aide des contrôles de l’étape du microscope et en sélectionnant l’option de marquage de point dans la boîte de dialogue de liste de points.
   REMARQUE : Un point de remplacement devra être sélectionné à chaque fois que le microscope est refocalisé sur un point de la liste des points. Cela peut se faire en focalisant le microscope sur le point approprié de la liste, puis en sélectionnant le bouton de remplacement du point . Il est important de ne pas toucher au bouton de réglage analogique grossier/fin lors du refocus ; Utilisez uniquement le logiciel pour ajuster la mise au point.
8. Définissez les paramètres de time-lapse en sélectionnant d’abord l’onglet design puis time-lapse dans la boîte de dialogue conception/exécution de l’expérience. Sélectionnez la case à cocher pour le time-lapse. Entrez les paramètres de time-lapse appropriés en termes d’images time-lapse/temps total.
9. Définir les points à imager à partir de la liste des points en sélectionnant d’abord l’onglet design puis points dans la boîte de dialogue conception/exécution de l’expérience. Sélectionnez l’option de liste des points de visite et entrez les points à imager dans la boîte de texte séparée par des virgules ou des traits d’union si la séquence est complète.
10. Avant de commencer une expérience, modifiez les noms et emplacements des fichiers à l’aide de l’onglet exécution de la boîte de dialogue design/exécution. L’emplacement du fichier peut être modifié en sélectionnant le bouton paramètres , en sélectionnant le dossier data, puis en sélectionnant le dossier approprié ou en créant un nouveau. Changez les noms des fichiers en entrant le nouveau nom dans la boîte de texte du nom du fichier image.
11. Commencez l’expérience en sélectionnant le bouton lecture dans la boîte de dialogue de commencer l’expérience .
    REMARQUE : Pour le time-lapse, vérifiez continuellement la mise au point à chaque champ de vision tout au long de l’expérience en utilisant le réglage DIC (pour éviter un photoblanchiment inutile) et refocalisez et mettez à jour les informations dans la liste des points, car les cellules ont tendance à se défocaliser avec le temps.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher BioReagents	BP160-100	Grade en biologie moléculaire - faible EEO
FM4-64	Invitrogen	T3166	Microscopie
Plat à fond en verre	MatTek	P35G-1.5-14-C	Microscopie
Microscope	GE	DeltaVision Elite	Pied de microscope inversé personnalisé Olympus IX-71 ; Tour d’illumination personnalisée et module d’éclairage à lumière transmise. Objectifs : PLAPON 60X (N.A. 1,42, WD 0,15 mm) ; OLY 100X HUILE (N.A. 1.4, WD 0,12 mm) ; DIC Prism Nomarski pour 100X Objective ; caméra CoolSnap HQ2 ; Assemblage SSI 7 couleurs ; Chambre de contrôle environnementale - opaque.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	Inhibiteur FtsZ
SoftWorx	GE		Logiciels d’imagerie fournis par le fabricant