$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Inoculation de Listeria monocytogenes chez les souris par injection dans la veine caudale et évaluation de la charge bactérienne dans le foie, la rate et le cœur
REMARQUE : Tous les travaux sur les animaux sont réalisés conformément aux directives de niveau 2 de biosécurité du CDC. Les souris sont généralement commandées une semaine à l’avance et enfermées avec 5 animaux par cage. Les souris sont autorisées à s’acclimater au nouvel environnement de laboratoire pendant quatre jours avant l’injection. Ces expériences ont utilisé des souris Swiss-Webster femelles âgées de 6 à 8 semaines, hébergées à 5 par cage dans un environnement barrière et nourries avec un régime non restreint.
- Préparez une cage de souris à la fois en retirant le couvercle et les bacs à nourriture/eau, puis en plaçant la cage sous une lampe chauffante pendant cinq minutes. Ce processus permet aux veines de la queue de se dilater, facilitant ainsi l’exécution des injections.
- Retirez un animal et placez-le dans un harnais (ou un tube faucon, l’extrémité coupée) afin de le maîtriser pendant l’injection.
- Nettoyez le site d’injection à l’aide d’une plaquette d’alcool et laissez l’alcool s’évaporer. Cela nettoie non seulement le site, mais dilate aussi davantage la veine de la queue.
- À l’aide d’une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de calibre 27,5, injectez doucement à la souris 200 μl de la culture désirée dans la veine caudalaire.
- Utilisez une gaze pour arrêter tout saignement pouvant survenir à la suite de l’injection, et placez l’animal dans une cage fraîche.
- Répétez ce processus pour les animaux et souches restants. Veillez à étiqueter chaque cage d’animaux avec la souche qu’ils ont reçue.
- Vérifiez les animaux quotidiennement, en retirant et en sacrifiant tout animal qui semble malade. Si aucun animal ne présente de signes de maladie, laissez les infections se poursuivre pendant 72 heures avant de sacrifier tous les animaux.
- Pour sacrifier, utilisez une anesthésie au CO2 provenant d’une source en bouteille jusqu’à ce que toutes les respirations soient arrêtées, puis utilisez une luxation cervicale afin de vous assurer que l’animal est mort.
- Après le sacrifice, déplacez les animaux dans une cagoule de culture tissulaire pour dissection.
- À l’aide d’un bloc de dissection, épinglez chaque jambe de l’animal avec des aiguilles de gros calibre et vaporisez l’animal à 70 % d’éthanol jusqu’à ce qu’il soit saturé.
- Coupez la peau de l’abdomen et du thorax à l’aide d’une incision en forme de Y qui s’étend de l’ouverture vaginale jusqu’au processus xiphoïde, puis remonte jusqu’à l’aisselle de chaque bras.
- Retirez la peau et retirez les aiguilles de chaque patte pour maintenir la dissection ouverte.
- Coupez doucement le péritoine, exposant les intestins, l’estomac, le foie et la rate.
- En coupant d’abord la veine hépatique et le ligament coronal au sommet du foie, on commence à retirer le foie. D’autres ligaments à retirer se trouvent sous le foie, le reliant à la première section de l’intestin grêle ainsi qu’à la musculature du dos.
- Placez le foie dans 5 ml de ddH20 stérile dans un tube de 50 ml à faucon.
- Ensuite, retirez la rate en l’isolant et en coupant doucement les vasculaires et les ligaments. La rate sera retirée plus facilement que le foie. Placez la rate dans un tube faucon séparé contenant 5 ml de ddHstérile 20.
- Localisez le diaphragme et coupez doucement le long de la cage thoracique afin de visualiser le thorax. Coupez à travers le processus xiphoïde et le sternum jusqu’au niveau du cou afin d’ouvrir le thorax, exposant ainsi le cœur et les poumons.
- À l’aide d’une pince, saisissez doucement le cœur par son apex et soulève-le de façon à ce que l’aorte et les vaisseaux pulmonaires soient en tension. Coupez ces vaisseaux pour libérer le cœur.
- Placez le cœur dans un tube Falcon de 50 ml contenant 5 ml de ddH20 stérile.
- Jetez la carcasse de la souris et répétez ce processus pour chaque animal, en utilisant des tubes de faucon propres contenant 5 ml de ddHstérile 20 pour chaque organe retiré.
- Après que tous les organes ont été retirés, nettoyez le poste de travail et retournez au établi.
- Préparez un ensemble de 5 tubes à utiliser pour nettoyer et stériliser l’homogénéisateur pour chaque ensemble d’organes provenant de cinq souris (c’est-à-dire un ensemble de 5 tubes pour 5 foies, 5 tubes pour 5 rates, et 5 tubes pour 5 cœurs). Quatre de chaque tube doivent être remplis de 30 ml de ddHstérile 20, et un de 30 ml d’EtOH à 90 %.
- À l’aide d’un TissueMaster (ou d’un homogénéiseur équivalent), plongez l’homogénéiseur (pendant l’exécution) dans les tubes préparés à l’étape 1.21 comme suit pour nettoyer la sonde :
- Tube 1 (ddH2O) 5 secondes dans le tube 2 (ddH2O) 5 secondes dans le tube 3 (EtOH) 5 secondes dans le tube 4 (ddH2O) 5 secondes dans le tube 5 (ddH2O)
- Homogénéisez un foie à l’aide de l’homogénéisant pendant au moins 2 minutes, ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus aucune partie visible de l’organe. Utilisez une pince à épiler pour enlever les gros débris de la sonde.
- Répétez le processus de nettoyage décrit.
- Répétez le processus d’homogénéisation pour les autres foies, en veillant à laver la sonde entre chaque foie en suivant le procédé décrit.
- Une fois que tous les foies sont complètement homogénéisés, il faut éliminer les tubes de lavage (1 à 5) pour le foie.
- Répétez le processus d’homogénéisation/nettoyage pour la rate et le cœur, en veillant à utiliser un nouveau jeu de tubes de lavage pour chaque série d’organes. Si à un moment donné les tubes de lavage deviennent troubles, jevez-les et remplacez-les par de nouveaux tubes pour finir la série.
- Après que tous les organes ont été homogénéisés, effectuez un dernier cycle de nettoyage sur l’homogénéisateur et séchez bien pour le stockage.
- Placez environ 200 μl de chaque organe dans un puits individuel d’une plaque à 96 puits.
- Effectuez des dilutions en série sur les échantillons d’organes en diluant 1:10 en série jusqu’à une dilution 1:10 000 (foie et rate) ou jusqu’à 1:1 000 (cœur).
- Placez la série de dilution sur un lagar LB préchauffé. Retirez également 20 ul de chaque organe non dilué et placez sur des plaques d’agar LB séparées afin d’énumérer la CFU des organes mal colonisés.
- Jetez les tubes du faucon contenant les organes homogénéisés, enveloppez les plaques à 96 puits contenant la série de dilution dans du parafilm et placez-les dans une boîte de congélation à -80 °C.
- Laissez sécher les taches. Ce processus est accéléré en plaçant les plaques dans la cagoule et en retirant les couvercles.
- Après que les taches ont séché, placez les assiettes dans un incubateur à 37 °C toute la nuit.
- Comptez le nombre de colonies dans chaque endroit le lendemain matin et utilisez la série de dilution pour calculer le nombre total de bactéries par organe.