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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Infection
- Obtenez des souris BALB/c des deux sexes entre 10 et 12 semaines.
REMARQUE : Streptococcus pneumoniae souche sérotype 4 TIGR4 est un isolat clinique virulent qui a été séquencé. - Cultivez TIGR4 dans un bouillon Todd-Hewitt à 37 °C avec 5 % deCO-2 jusqu’à atteindre une densité optique (OD)620 de 0,5 (correspondant à 1,0 x 108 unités formant des colonies [UFC]/ml). Pelletez la culture pneumococcique par centrifugation pendant 10 minutes à 3 500 x g et retirez le surnageant à l’aide d’une ligne sous vide. Suspendre et diluer les bactéries avec une solution stérile phosphatée tamponnée (PBS) jusqu’à une concentration finale de 1,0 x 104 UFC/ml.
- À l’aide d’une chambre d’induction, on anesthésie les souris avec 2,5 % d’isoflurane vaporisé en oxygène. Confirmez l’état d’anesthésie par une légère pincée de l’orteil avec une pince émoussée.
- En tenant la souris anesthésiée par la peau du cou et en position verticale d’une main, injecter à chaque souris intrapéritonéalement (i.p.) 100 μl de la suspension de S. pneumoniae à l’aide d’une seringue avec une aiguille de calibre 27-30 (correspondant à une dose de stimulation de 1,0 x 103 UFC). Remettez la souris dans sa cage. Les souris se réveillent généralement 30 à 40 secondes après l’injection.
- Laissez l’infection se propager pendant au moins 24 heures (au début) ou 30 heures (avancées).
- Euthanasiez les souris par asphyxie au CO2 . Effectuer une luxation cervicale pour s’assurer que la souris est décédée. L’euthanasie est confirmée par l’ablation du cœur à l’étape 1.6.
- Désinfectez la queue avec un écovillon d’alcool et coupez une section de 2 à 3 mm. Prélever 2 μl de sang et diluer le sang en série de 10 fois dans du PBS contenant de l’héparine sodique 1 U/ml cinq fois. Dilutions en série sur une plaque d’agar sanguine de soja tryptique et incuber toute la nuit à 37 °C dans 5 % deCO2. Le lendemain, la colonne extrapole le niveau de bactériémie.
- Immobilisez la souris en position couchée sur une plateforme chirurgicale. Vaporisez la poitrine avec de l’éthanol à 70 % et séchez à la légère. À l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces, ouvrez la cavité thoracique, retirez la cage thoracique et découpez le diaphragme pour exposer le cœur et les poumons. À l’aide de ciseaux, coupez les vaisseaux sanguins reliés au cœur et excisez doucement le cœur avec soin pour éviter les ecchymoses à la pince.
- Rincez le cœur avec du PBS puis placez-le dans des cassettes de collecte d’échantillons de tissu afin que des sections coronales soient obtenues lors du coupage tissulaire. Pour l’immersion de paraffine, placez les cassettes dans une solution de formol tamponné à 10 %, puis le lendemain, envoyez l’immersion de paraffine.
- Sinon, la congélation éclair en utilisant un composé à température de coupe optimale (O.C.T.) dans un cryomold placé sur de la glace sèche.
2. Visualisation des lésions cardiaques et des pneumocoques à l’intérieur des lésions
- Coupez les sections cardiaques incrustées de paraffine de sorte que les 4 cavités du cœur soient visibles dans chaque section tissulaire. Couper les lames à une épaisseur de 5 μm.
- Déparaffinez et colorez les lames avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) en utilisant des méthodes standard.
- Observez les coupes cardiaques colorées à H&E au microscope optique à faible (100X, 200X) et à haute (immersion en huile : 400X, 1 000X). Caractériser les cœurs pour la présence de microlésions dans le myocarde. Ici, acquérez des images H&E à l’aide d’un microscope Zeiss Axioskop 2 équipé d’un objectif numérique Plan-NEOFLUAR à ouverture numérique 100X 1,3.
REMARQUE : À des stades précoces, les lésions cardiaques sont distinguées par leur apparence de couleur différente et, dans certains cas, par la présence de cellules immunitaires (monocytes et granulocytes), qui semblent être des monocytes. Dans les lésions avancées, en particulier celles observées à 30 heures, les cellules immunitaires sont absentes, et de grandes lésions de type vacuole sont observées à leur place. Il est important de noter que, bien que l’influx de cellules immunitaires puisse survenir aux premiers stades du développement de la lésion cardiaque, cela ne semble pas être une nécessité.