Détection par PCR des agents pathogènes d’origine alimentaire à partir d’échantillons enrichis de mouches

Résumé

Source : Pava-Ripoll, et al. Détection de pathogènes bactériens d’origine alimentaire à partir de mouches de saleté individuelles. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo démontre une méthode basée sur la PCR qui amplifie l’ADN bactérien cible à partir d’échantillons enrichis de mouches à l’aide de comprimés spécifiques à chaque pathogène, permettant la détection en temps réel de la fluorescence et l’analyse de la courbe de fusion pour confirmer la présence d’agents pathogènes d’origine alimentaire chez des insectes individuels.

Protocole

1. Comprimés prêts pour la PCR (réaction en chaîne de la polymérase) à l’hydrate

1. Sélectionnez un bloc de refroidissement PCR refroidi (4 °C) et placez un support à tube PCR sur l’insert.
2. Placez les tubes PCR correspondants contenant les comprimés prêts pour la PCR (inclus avec chaque kit) pour le pathogène alimentaire ciblé dans le support, selon le fichier du rack.
3. À l’aide de l’outil de débouchage, retirez soigneusement les condensateurs des tubes PCR. Jetez les bouchons et vérifiez que chaque tube contient un comprimé.
4. Transférer 50 μl (pour Salmonella et Cronobacter) ou 30 μl (pour L. monocytogenes) de lysat vers des tubes PCR spécifiques. Utilisez de nouveaux condensateurs optiques et fixez-les fermement sur les tubes PCR à l’aide de l’outil de bouchage.
   REMARQUE : Après avoir ajouté le lysat aux comprimés prêts pour la PCR, les échantillons doivent rester refroidis à 2 à 8 °C jusqu’à leur chargement dans le système de détection basé sur la PCR. Les tubes PCR peuvent être centrifugés à 2 500 x g pendant quelques secondes afin de garantir que le volume complet se trouve au fond du tube.
5. Chargez les tubes PCR dans l’instrument du cycleur/détection PCR en ouvrant le tiroir à instruments.
6. Placez le rack de tubes PCR dans les puits du tiroir et vérifiez que les tubes sont bien bien installés.
7. Fermez le tiroir et lancez le programme tel que décrit par le protocole du fabricant.
   REMARQUE : L’instrument basé sur la PCR dispose de paramètres de cycle prédéfinis pour chaque agent pathogène d’origine alimentaire.
8. Vérifiez que la barre de statut du cycle PCR affiche une barre bleue indiquant que la partie amplification du programme est en cours.
   REMARQUE : Pour les tests PCR standards, le temps de traitement complet du programme (amplification et détection) prend environ 3 à 3,5 heures à être complété.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Outil de coiffage	DuPont	D11677028
Outil de décapsulation	DuPont	D11134095
Rack/support de tubes PCR	DuPont	D12701663
Pinces à pointe fine, pointe droite	BioQuip	4731	Syliciser avant utilisation. Plusieurs fournisseurs.
Bloc de refroidissement			Plusieurs fournisseurs.
Centrifugeuse			Plusieurs fournisseurs.