Un test rapide basé sur l’image pour le dépistage de la virulence bactérienne induite par la surface

Résumé

Source : Perinbam, K., et Siryaporn, A. Un test rapide de virulence bactérienne basé sur l’image, utilisant des amibes. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre une méthode rapide basée sur l’image pour évaluer la virulence bactérienne en incubant des amibes avec des bactéries attachées à la surface ou planctoniques, en appliquant un coussinet d’agarose calcéine-acétoxyméthyl (calcein-AM), et en imageant la fluorescence pour détecter les dommages aux cellules hôtes.

Protocole

1. Microscopie - Préparation de la tampon d’agar

1. Préparez les compresses d’agar environ 30 minutes à 1 heure avant que les amibes ne soient prêtes à être mélangées à Pseudomonas aeruginosa.
2. Faites chauffer 50 mL d’agar à 1 % (p/v) dans un tampon de développement (DB) dans une fiole de 250 mL. Mélangez tous les 20 secondes jusqu’à ce que les amas d’agar disparaissent.
3. Refroidissez l’agar en fusion en le plaçant dans un bain-marie préchauffé à 55 °C pendant 15 minutes.
4. Ajoutez 15 μL de la solution stock calcein-AM à 15 mL d’agar en fusion dans un tube conique. Mélangez en inversant doucement le tube 4 à 5 fois, puis passez immédiatement à l’étape suivante.
   REMARQUE : Effectuez cette étape dans un tube centrifugeuse en polypropylène de 15 mL. N’utilisez pas un récipient en verre épais, car cela ferait solidifier trop vite l’agar.
5. Versez le mélange d’agar en fusion sur une plaque en verre de 12 cm x 10 cm et laissez l’agar solidifier pendant 10 minutes à température ambiante. Découpez la tamponne d’agar solidifiée en sections plus petites de 1,5 cm x 1,5 cm en plaçant la plaque de verre sur une grille imprimée et en coupant le long de la grille à l’aide d’une règle métallique.
6. Gardez le gel hydraté dans une boîte humide jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé.

2. Microscopie - Préparation de l’échantillon bactérie-amibe pour imagerie

1. Pour tester la virulence des cellules bactériennes attachées à la surface, ajoutez 10 μL de cellules d’amibe aux bactéries attachées à la surface.
   REMARQUE : Cette étape décrit le mélange d’amibes avec des bactéries.
2. Pour tester la virulence des cellules planctoniques, mélangez 10 μL de cellules d’amibe avec 10 μL de bactéries planctoniques.
   REMARQUE : Ne lavez pas les cellules d’amibe développées de façon axénienne (à un OD_{de 600} de 0,2 à 0,5) avant de les mélanger avec les bactéries. Aucune croissance d’E. coli ne sera observée dans la culture d’amibes grâce à l’utilisation de la solution antibiotique-antimycotique.
3. Placez immédiatement le tampon d’agar calcein-AM de 1,5 cm x 1,5 cm de l’étape 1,5 sur le mélange bactérie-amibe à la surface de la boîte de Petri.
   REMARQUE : Placez la tampon d’agar sur le mélange en effectuant un mouvement rapide et fluide. Ne baissez pas lentement le coussinet sur le mélange, car ce mouvement tend à pousser les cellules vers la périphérie et à l’écart du dessous du coussinet. Cette étape garantira que bactéries et amibes sont uniformément mélangées, immobilisées et que les deux types cellulaires sont confinés au même plan.
4. Éliminez l’excès de liquide en pipettant doucement tout liquide restant autour de la tampon d’agar. Laissez sécher la boîte de Petri pendant 20 minutes à température ambiante.
5. Couvrez la boîte de Petri avec un couvercle et incubez le mélange d’amibes-bactéries immobilisé à température ambiante pendant 40 minutes supplémentaires. Passez à l’étape 3.1.
   REMARQUE : Il est important d’incuber tous les échantillons pendant la même durée, car la fluorescence de fond augmente avec le temps. Un temps d’incubation d'1 heure est recommandé. Les incubations de plus d'1 h sont moins reproductibles car les cellules d’amibes peuvent commencer à éclater.

3. Microscopie - Acquisition d’images

1. Imagez les amibes à l’aide d’un microscope à fluorescence capable d’acquérir des images en champ clair et en fluorescence verte. Pour la fluorescence verte, utilisez des filtres à protéines de fluorescence verte (GFP) avec 474/27 nm et 525/45 nm respectivement pour l’excitation et l’émission. Utilisez un objectif numérique de 10X (≥0,3 ouverture) pour imager les amibes.
   REMARQUE : La calcéine-AM dans l’agar provoquera la fluorescence des amibes mourantes dans le canal de fluorescence verte. Les amibes saines ne sont pas fluorescentes par ailleurs.
2. Ajustez les temps d’acquisition pour le contraste de phase, les canaux GFP pour limiter la phototoxicité et optimiser la plage dynamique des intensités d’image. Substituez le contraste de phase par contraste différentiel d’interférence (DIC) si nécessaire.
   REMARQUE : Utilisez des expositions de 100 à 200 ms pour le contraste de phase et la fluorescence GFP si possible. Gardez les réglages d’exposition et d’instruments inchangés pendant toute l’expérience. C’est crucial pour calculer l’indice de destruction de l’hôte.
3. Acquérir des images d’au moins 100 cellules d’amibe afin d’obtenir de bonnes statistiques pour calculer l’indice de destruction de l’hôte.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
Bacto agar, déshydraté	BD Difco	214010
Antibiotique-Antimycotique (100X)	Technologies de vie	15240062	Aliquotes < 1 mL et conservées à -20 °C
Ester de calcéine-acétoxyméthyl (calcéine-AM)	Technologies de vie	C34852	Calcéine Acétoxyméthyl (AM)
Chlorure de calcium, anhydre	Sigma-Aldrich	C1016
D-glucose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Diméthylsulfoxyde	Sigma-Aldrich	D5879
Acide folique	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	M8266
Extrait de levure	Oxoïde	LP0021
Peptone spécial	Oxoïde	LP0072
Hyroxide de potassium	Fisher Chemical	P250
Monobase phosphate de potassium	Sigma-Aldrich	P0662
Phosphate de sodium dibase heptahydrate	Fisher Chemical	S373
Vitamine B12	Sigma-Aldrich	V2876
Souches
Discoïdien dictyostelium	Laboratoire Siryaporn	Strain AX318
Escherichia coli	Laboratoire Siryaporn	Souche B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Laboratoire Siryaporn	PA14	Souche PA14
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Laboratoire Siryaporn	AFS20.1	Souche20 dérivée du PA14
Fournitures
Filtre 0,22 μm	Millipore	SCGPT01RE	Pour la stérilisation par filtre
Tube conique, 15 mL	Corning	352097
Bouteilles de stockage en verre	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Boîte de Petri, 6 cm de diamètre	Corning	351007	Plaques de polystyrène de 60 x 15 mm
Boîte de Petri, diamètre de 10 cm	Fisher	FB0875712	Plaques en polystyrène de 100 x 15 mm
Contenants en plastique avec couvercle	Ziploc	2,57E+09	Contenants carrés de 3 tasses
Plaques en verre	Bio-Rad	1653308	Pour préparer des compresses d’agar. D’autres plaques de verre peuvent être utilisées avec des dimensions similaires.
Bâtons en bois	Fisher	23-400-102
Équipement
Microscope Eclipse Ti-E	Nikon	MEA53100	Installation du microscope
10X Plan Fluor Ph1 objectif 0,3 NA	Nikon	MRH20101	Installation du microscope
Source d’excitation de fluorescence	Lumencor	Moteur léger Sola	Installation du microscope
Ensemble de filtres à fluorescence	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Installation du microscope
Appareil photo Orca Flash 4.0 V2	Hamamatsu	77054098	Installation du microscope
ImageJ	NIH	v. 1.49	Logiciels pour l’analyse d’images
MATLAB	Mathworks	R2013	Logiciels pour l’analyse d’images
Incubateur à shaker orbital	VWR	89032-092	Pour la croissance de bactéries à 37 °C
Vibrateur de plateforme	Fisher	13-687-700	Pour la croissance d’amibes à 22 °C
Spectrophotomètre	Biochrom	Ultrospec 10
Incubateur réfrigéré sous le comptoir	Fisher	97990E	Pour la croissance d’amibes à 22 °C
Bain marie isotemp	Fisher	15-462-21Q	Pour un média de refroidissement jusqu’à 55 °C