Évaluation de la charge bactérienne dans la rate de souris pour des études d’infection

Résumé

Source : Madenspacher, J. H. et Fessler, M. B. Une méthode non invasive et techniquement non intensive pour l’induction et le phénotypage de la pneumonie bactérienne expérimentale chez la souris. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre le processus de quantification de la charge bactérienne dans la rate d’une souris infectée afin d’évaluer la gravité de l’infection. La rate homogénéisée est diluée en série et placée pour déterminer la charge bactérienne totale. Les données résultantes fournissent des informations sur les interactions hôte-pathogène au sein des tissus systémiques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Aspiration intratrachéale murine de Klebsiella pneumoniae à partir de l’oropharynx

1. Assurez-vous que les souris sont identifiées de manière unique par une marque de queue, un tatouage ou un autre identifiant approuvé.
2. Préparez un inoculum doseur des bactéries à l’aide d’une pipette P200 avant de retirer les souris de l’isoflurane afin d’accélérer la procédure. Pour de meilleurs résultats avec l’aspiration d’i.t., utilisez un volume de <100 μl pour éviter le débordement. Ici, utilisez 2000 unités formatrices de colonies (UFC)/50 μl de K. pneumoniae.
3. Anesthésiez les souris dans une chambre transparente avec du gaz isoflurane (par exemple, 2 % d’isoflurane à un débit de 1 L/min) ou selon les directives institutionnelles. Le nombre de souris à anesthésier ensemble est déterminé par le niveau de confort de l’expérimentateur, généralement 1 à 2 à la fois. Observez la respiration et confirmez le niveau d’anesthésie une fois que les respirations profondes sont visibles, et que 2 à 3 secondes peuvent être comptées entre les respirations. REMARQUE : S’il existe des inquiétudes quant aux effets confondants possibles des anesthésiques volatils (inhalés), l’anesthésie peut être obtenue par une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine. Avec la méthode décrite ci-dessus, l’anesthésie profonde ne dure que quelques minutes. Si une anesthésie prolongée est induite, une pommade oculaire doit être utilisée pour prévenir la dessiccation oculaire.
4. Une fois la souris anesthésiée, on la place en position semi-couchée couchée, suspendue par les incisives maxillaires à un élastique tendu entre des chevilles sur une planche inclinée en Plexiglas (Figure 1).
5. Tirez doucement la langue de souris sur le côté avec une pince émoussée et non striée, puis déposez la dose dans la cavité buccale à l’aide d’une pipette P200. Faites preuve de très attention pour éviter de provoquer un traumatisme à la langue ou à l’oropharynx.
6. Tout en gardant la langue rétractée, bouchez doucement le nez avec un doigt ganté jusqu’à ce que la souris inspire. Continuez à couvrir le nez jusqu’à ce que la souris ait pris deux inspirations ou plus, et qu’aucun liquide ne soit visible dans la cavité buccale. Couvrir le nez aide à s’assurer que la souris inhalera les bactéries dans les poumons, car les souris sont des respirateurs narinaires obligatoires.
7. Retirez la souris de la planche d’inoculation et revenez dans sa cage, en la plaçant sur le dos pour éviter que la litière ou les débris ne bloquent les narines pendant la convalescence de l’anesthésie.
8. Une fois que toutes les souris ont été dosées et se sont réveillées de l’anesthésie, utilisez des souris d’intérieur dans un cubicule/pièce contenant uniquement des souris ayant reçu une dose de K. pneumoniae. Surveillez les souris quotidiennement, y compris leur poids corporel, si vous dépassez 48 heures après l’infection.
9. Utilisez un écrasement quotidien et/ou une chaleur supplémentaire si vous laissez les souris dépasser 48 heures.

2. Détermination de la charge bactérienne dans les tissus pulmonaires et périphériques

1. Avant de commencer : préparez des tubes de dilution avec 900 μl de 1x solution saline phosphatée tamponnée (PBS) pour les poumons et la rate et 90 μl de 1x PBS pour le sang. Plaques d’étiquetage pour la culture des bactéries et fixées à température ambiante ; Ainsi, une fois le tissu collecté, le temps entre l’homogénéisation et le plaque pour la croissance bactérienne sera minimisé.
   REMARQUE : En raison du dépôt hétérogène de bactéries dans les poumons poumons qui peut se produire lors de l’aspiration, il est recommandé d’utiliser des souris individuelles pour l’analyse soit de la cellularité totale des voies respiratoires, soit de la charge bactérienne totale (bilatérale) pulmonaire.
2. Euthanasiez les souris selon les directives institutionnelles. Ici, utilisez une injection létale de 150 mg/kg de pentobarbital sodique ou une dose équivalente de solution d’euthanasie commerciale, suivie d’une exsanguination, car cela évite d’éventuelles complications pulmonaires associées à l’inhalation de CO₂ et à une luxation cervicale.
3. Retirez la rate et mettez-la dans 2 ml de 1x PBS. Posez les tubes sur de la glace. Veillez à nettoyer les instruments avec de l’éthanol entre chaque mouchoir/souris.
4. Homogénéisez le tissu sur glace, de préférence avec des homogénéiseurs jetables pouvant être changés entre chaque échantillon. Les embouts homogénéiseurs jetables peuvent être autoclavés pour être réutilisés entre les expériences.
5. Une fois le tissu homogénéisé, effectuer des dilutions en série et plaquer. Échantillons en plaques d’un tissu/dilution donné en double sur une seule plaque d’agar de soja tryptique (TSA) en traçant une ligne de démarcation sur le plastique. Les suggestions de placage et de dilution sont indiquées ci-dessous (dans tous les cas, 10 μl d’échantillon sont étalés sur la plaque) et reposent sur une nécropsie 24 heures après l’infection. Si l’on analyse des échantillons de 48 à 72 heures, un plus grand nombre de dilutions peut devoir être placé en raison de l’augmentation de la charge bactérienne à des moments ultérieurs
   1. Pour la rate, diluez 1:10-1:100 en ajoutant 100 μl de rate homogénéisée à 900 μl de PBS stérile 1x en série. Plaque homogénée proprement et les deux dilutions en double.
6. Laissez sécher brièvement les échantillons d’étalage.
7. Inversez les plaques TSA et placez-les dans un incubateur statique à 37 °C toute la nuit.
8. Déterminez le nombre de bactéries colonisatrices en moyennant les colonies bactériennes des deux côtés de la plaque et de chaque dilution. Prenez en compte les dilutions initiales de 5 ml pour le poumon et 2 ml pour la rate afin de déterminer les UFC totales tissulaires.

Résultats

Figure 1 : Tableau de procédure pour pneumonie par aspiration chez la souris. Les souris d’étude sont positionnées, tête vers le haut et dos à la planche (c’est-à-dire semi-couchée), suspendues par les incisives à un élastique te...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ATCC	43816
Becton Dickenson	211825
Préparé en interne	N/D	Eau distillée (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na₂HPO₄ (5,75 g), KH₂PO₄ (1 g)