Visualisation des métabolites des acides aminés dans les tissus intestinaux de souris infectées

Résumé

Source : Specker, J. T., et al. Investigation de la coopération microbienne par imagerie par spectrométrie de masse des colonies bactériennes cultivées sur l’agar et dans les tissus lors d’une infection. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre l’utilisation de la spectrométrie de masse assistée par la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) pour visualiser la distribution des acides aminés dans les tissus intestinaux de souris infectées par Clostridioides difficile, seule ou en combinaison avec Enterococcus faecalis. La procédure implique la préparation des tissus, l’application de matrices, l’ionisation laser et la détection d’ions acides aminés pour générer des images spatiales d’ions. Les résultats révèlent une coopération microbienne, car E. faecalis modifie l’environnement intestinal en libérant de l’ornithine et en appauvrissant l’arginine, renforçant ainsi la pathogenèse de C. difficile .

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation et expédition des tissus cécals de souris non infectés et de C. difficile
   1. Inoculez des mâles C57BL/6 mâles âgés de 4 à 8 semaines avec des antibiotiques (0,5 mg/mL de céfoperazone ou 0,5 mg/mL de céfoperazone + 1 mg/mL de vancomycine) à volonté pendant 5 jours, suivis d’une période de récupération de 2 jours suivie d’une infection.
   2. Euthanasiez les animaux par asphyxie au CO₂ et prélevez immédiatement l’organe du cecum de la souris. Incorporez dans un mélange à 20 % de composé à température de coupe optimale (OCT) dans de l’eau distillée.
   3. placer les échantillons sur de la glace sèche, puis les emballer et les envoyer pour analyse ; Conserver à -80 °C jusqu’à analyse.

 

2. Cryosectionnement des témoins non infectés versus les tissus cécals de souris infectés par C. difficile

1. Nettoyez tout le matériel de cryosection en rinçant avec de l’éthanol à 100 % et laissez sécher avant de placer les échantillons dans la chambre du cryostat. Préparez des lames de microscope recouvertes d’ITO en utilisant un ohmmètre pour identifier le côté de la lame avec le revêtement conducteur. Utilisez une gravure à pointe losange pour graver et étiqueter le côté de la lame recouverte d’ITO du microscope.
   REMARQUE : Un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, des lunettes de laboratoire, une blouse de laboratoire et des manches de cryostat, doit être porté.
2. Effectuez une cryosectionne sur un cryomicrotome de recherche. Transférez les tissus de ceca de souris intégrés à OCT d’un congélateur à -80 °C vers la chambre de cryomicrotome (température de chambre de 30 °C, température de -28 °C de l’objet) sur de la glace sèche. Montez les échantillons de tissu à comparer par spectrométrie de masse d’imagerie (par exemple, témoins non infectés vs. infectés par C. difficile) sur la même lame de microscope afin d’assurer une préparation d’échantillon identique des deux types de tissus et permettre des comparaisons précises des métabolites.
3. À l’intérieur de la chambre de cryomicrotome, montez le tissu incrusté d’OCT sur un mandrin d’échantillon à l’aide d’une solution OCT supplémentaire. Après que la solution OCT s’est solidifiée, fixez le mandrin à la tête de l’échantillon. Commencez la cryosection par incréments de 10 à 50 μm pour atteindre la profondeur/plan tissulaire désiré de l’organe.
4. Une fois la section transversale optimale du tissu atteinte, commencez à collecter des sections à une épaisseur de 12 μm. Manipulez délicatement la tranche à l’aide de pinceaux d’artiste et placez-la sur une lame de microscope recouverte de Téflon.
5. Roulez la lame de microscope recouverte d’ITO sur la section de tissu pour récupérer le tissu de la lame recouverte de Téflon. Dégelez la section tissulaire sur la lame de microscope en pressant la paume à l’arrière de la lame recouverte d’ITO. Continuez à décongeler le support jusqu’à ce que la section tissu passe de translucide à une texture opaque/mate.
6. Transférez les lames de microscope montées sur tissu sur de la glace sèche dans une boîte sèche avec dessiccant pour une analyse le jour même, ou conservez à -80 °C pour un stockage à plus long terme.

3. Préparation du témoin non infecté contre les tissus cécales de souris infectés par C. difficile pour application matricielle et spectrométrie de masse par imagerie MALDI

1. Effectuer l’application de la matrice MALDI (température de buse de 30 °C, huit passages, débit de 0,1 mL/min, motif CC, temps de séchage de 0 s, 10 psi).
2. Réaliser la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI
3. Analysez les images d’ions de multiples réplications biologiques et comparez les résultats pour leur signification via des comparaisons de boîtes d’intensité à l’aide du logiciel statistique SCiLS mentionné ci-dessus.
   REMARQUE : Les tests statistiques et comparaisons appropriés dépendront de l’application et peuvent inclure la segmentation spatiale, des modèles de classification et une analyse comparative pour déterminer des caractéristiques spectrales discriminantes et corrélées. Les analyses comparatives peuvent inclure l’attribution de valeurs p à des caractéristiques significatives, la génération d’analyses en composantes principales pour la comparaison tissulaire, et la visualisation de diagrammes en boîte pour identifier les variations. Il est également utile de visualiser le tissu à l’aide de la microscopie en champ clair de la section tissulaire colorée par hématoxyline et éosine (H&E) après spectrométrie de masse par imagerie. Cela permet une identification claire des caractéristiques morphologiques dans le tissu et peut être analysé en consultation avec un pathologiste formé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtres à seringue Titan3 en nylon 0,2 μm	Thermo Scientific	42225-NN
Matrice MALDI 1,5-diaminonaphtalène	Sigma Aldrich	2243-62-1
Seringues Henke Ject luer lock de 20 mL	Henke Sass Loup	4200.000V0
Jauge à vide à convection série 275i	Société Kurt J. Lesker	KJL275807LL
Spectromètre de masse 7T solariX FTICR équipé d’un système laser Smartbeam II Nd :YAG MALDI (2 kHz, 355 nm)	Bruker Daltonics
Solution d’acide acétique, adaptée au HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
Acétonitrule, adapté au HPLC, gradient de ≥99,9 %	Sigma Aldrich	75-05-8
Solution d’hydroxyde d’ammonium, 28 % de NH3 dans l’H2O, ≥99,99 % de base de métaux traces	Sigma Aldrich	1336-21-6
Sacs autoclavables pour biohazards : 55 gallons	Grainger	45TV10
Sacs de transport pour échantillons de biohazard (8 x 8 in)	Fisher Scientific	01-800-07
Bouillon d’infusion cérébrale	BD Biosciences	90003-040
C57BL/6 souris mâles	Laboratoires Jackson
Scanner photo et de documents CanoScan 9000F Mark II	Canon
Cryomicrotome de recherche CM 3050S	Leica Biosystems
Armoire dessiccatrice	Sigma Aldrich	Z268135
Graveur de pointes diamantées, Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific	50-254-51
Pellets dessiccants à la driérite	Drierite	21005
Éthanol, 200 proof	Laboratoires de décontamination	2701
Logiciel flexImaging	Bruker Daltonics
Logiciel ftmsControl	Bruker Daltonics
Aspirateur en verre	Sigma Aldrich	Z549460
Pulvérisateur robotisé HTX M5 TM	HTX Technologies
Lames de microscope recouvertes d’oxyde d’indium-étain (ITO)	Delta Technologies	CG-81IN-S115
Filtre HEPA en ligne vers pompe à vide	LABCONCO	7386500
Méthanol, grade HPLC	Fisher Chemical	67-56-1
Adaptateur culitaire MTP II	Bruker Daltonics	235380
Composé à température de coupe optimale (OCT)	Fischer Scientific	23-730-571
Sporicide, désinfectant et nettoyant Peridox RTU	CONTEC	CR85335
Lames imprimées en PTFE (Téflon), Electron Microscopy Sciences	VWR	100488-874
Pompe à vide à palettes rotatives RV8	Edwards	A65401903
Lames jetables à profil haut Tissue-Tek Accu-Edge pour microtomes	Sciences de la microscopie électronique	63068-HP
Tube à vide transparent	Cole Palmer	EW-06414-30
Huile de pompe à vide Ultragrade 19	Edwards	H11025011
Transformateur à tension variable	Powerstat
Eau, adaptée au HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
Flasque Dewar à large ouverture	Sigma Aldrich	Z120790