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1. Évaluation de l’effet des inhibiteurs de petites molécules sur la formation de pellicules et de colonies de biofilms
- Préparez une solution 2x de milieu MSgg (glutamate-glycérol monosodique) induisant le biofilm défini, sans chlorure de calcium ni chlorure de fer(III) hexahydraté. Après la stérilisation au filtre, ajoutez le chlorure de calcium. Le milieu est prêt à être utilisé directement, ou peut être stocké à 4 °C dans l’obscurité.
- Préparez la dilution 1x MSgg le jour de l’expérience.
- Diluez le milieu 2x MSgg à 1x avec de l’eau distillée stérile (pellicules) ou de l’agar chaud stérile à 3 % (80 °C) (biofilms) et ajoutez du chlorure de fer(III) hexahydraté à une concentration finale de 50 μM (pellicules) ou 250 μM (biofilms). Ajoutez des antibiotiques ou des inhibiteurs de petites molécules à la concentration souhaitée et mélangez bien. Par exemple, pour obtenir une concentration finale de 0,5 mM de D-leucine dans 30 ml afin d’établir des pellicules ou des biofilms, ajoutez 196,6 μl d’une solution de D-leucine de 76,3 mM (10 mg/ml).
REMARQUE : La composition finale 1x MSgg est décrite dans le Tableau 1. Comparé à la recette originale, le milieu contenait 50 μg/ml de thréonine, et la concentration en fer nécessaire pour faire pousser des colonies de biofilms sur un milieu solide MSgg a été multipliée par 2,5 pour optimiser la morphologie des colonies plissées.
- Après la solidification de l’agar, séchez les plaques solides de MSgg dans une cagoule biologique pendant 30 à 45 minutes avant l’inoculation.
- Pour sélectionner des inhibiteurs spécifiques qui interfèrent avec les mécanismes de formation des pellicules (Figure 1), il faut exclure que les concentrations utilisées influencent la croissance planctonique et statique.
- Déterminez la croissance planctonique (augmentation de la densité optique au fil du temps en culture liquide) sur une courbe de croissance simple en mesurant la densité optique à 600 nm chaque heure jusqu’à la phase de croissance stationnaire.
- Pour confirmer que la turbidité mesurée en culture représente le nombre de cellules vivantes, déterminez le nombre d’unités formant des colonies (UFC) de cellules dans la phase de croissance planctonique à partir d’une culture secouée à plusieurs moments précis.
- Pour évaluer l’effet des inhibiteurs de petites molécules sur la croissance statique des pellicules, prélever des cellules à la fin d’une incubation de 3 jours à 23 °C à partir d’un puits de culture cellulaire de 24 puits, inoculé dans les mêmes conditions que décrites aux sections 1.7-1.9, et déterminer l’UFC. Pour ce contrôle, utilisez une déformation déficiente en pellicule qui ne possède pas les opérons codant pour les composantes de la matrice extracellulaire (c’est-à-dire B. subtilis ΔepsH, ΔtasA).
REMARQUE : Cette souche est capable de croître dans des conditions statiques, mais contrairement à un type sauvage formant des pellicules, elle est déficiente de la capacité à flotter vers l’interface liquide-air, où la croissance est favorisée en raison de l’augmentation des niveaux d’oxygène. Ainsi, cette souche extracellulaire déficiente en matrice et en pellicule est une souche de référence recommandée pour évaluer la croissance dans des conditions statiques.
REMARQUE : Pour l’exemple précis de l’acide aminé D non canonique D-leucine décrit ci-dessous, un effet sur la croissance planctonique et statique à des concentrations qui interférait avec la formation de la pellicule a été écarté. Les méthodes pour déterminer la croissance planctonique et statique sont décrites en détail.
- Extraire B. subtilis d’un stock à -80 °C (culture LB de 109 cellules/ml congelées dans 20 % de glycérol) pour isoler des colonies simples sur une plaque d’agar LB-1,5 % à l’aide d’une pointe stérile ou d’un bâton applicateur.
- Faites pousser toute la nuit à 30 °C.
- ÉTAPE CRITIQUE : Pour une inhibition robuste de la pellicule par les acides aminés D non canoniques tels que la D-leucine, cultivez une seule colonie prélevée sur la plaque d’agar LB-1,5 % dans un bouillon de 3 ml LB à 37 °C pendant 4 heures dans un incubateur secouant (vitesse de secouage 200 tr/min). Remplacez le bouillon LB par un milieu MSgg induisant le biofilm avant l’inoculation en centrifugant 1,5 ml de culture de démarrage pendant 4 minutes à 6 000 x g, en retirant soigneusement le surnageant, puis en resuspendant le pellet dans un milieu MSgg de 1,5 ml. Le reste de la culture peut être abandonné. Important : Pour garantir la robustesse du système, la densité optique à 600 nm (OD600) de la culture de démarrage lavée doit être comprise entre 0,6 et 1.
- Lors de la croissance de la culture de démarrage, préparez une plaque multi-vaisselle de culture cellulaire à 12 puits contenant 3 ml de milieu MSgg sans ou avec une plage de concentration de l’inhibiteur de la petite molécule (par exemple, 0,3, 0,5, 1 mM de D-leucine). Pour exclure les effets de bord, répartissez la position des différentes concentrations sur la plaque multi-plats. Sinon, utilisez des plaques multidish de culture cellulaire à 24 puits contenant 1,5 ml de milieu MSgg.
- Inoculez les puits de la plaque multi-vaiselles de culture cellulaire à 12 puits avec 3 μl de la culture de démarrage lavée (dilution 1:1 000).
REMARQUE : Un ratio de dilution plus faible, c’est-à-dire 1:500, peut être utilisé. Cela réduit le temps de développement des pellicules. - Faites pousser les pellicules à 23 °C dans des conditions statiques pendant trois jours. Ne déplacez pas les pellicules pendant ce temps, car cela peut affecter la morphologie finale de la surface de la pellicule.
- Prenez des photos avec des jumelles et une exposition homogène à la foudre. Sinon, prenez une photo des pellicules avec un appareil photo haute résolution. Pour éviter les artefacts causés par des angles de lumière et des ombres incohérents, prenez des photos de dessus avec l’appareil fixé sur un trépied et utilisez une source lumineuse douce et large à 45° des deux côtés.
REMARQUE : Une méthode alternative pour étudier la multicellularité de B. subtilis est le test de colonie de biofilms sur un milieu solide de MSgg induit par le biofilm. Comme les pellicules, ce test permet d’étudier les processus spatiotemporaux. Une fois la gamme active des inhibiteurs de petites molécules déterminée, leur effet sur la formation des colonies de biofilms peut être étudié. - Pour cultiver des colonies de biofilm, placez symétriquement 1,5 μl de la pré-culture non lavée (étape 1.7) sur la plaque d’agar MSgg séchée à 1,5 % à l’aide d’un gabarit — 4 gouttes par boîte de Petri de 8,5 cm de diamètre. Laissez les gouttes s’absorber sur la plaque avant de les déplacer.
REMARQUE : Le modèle permet d’obtenir une répartition égale des colonies de biofilms dans la zone où les cellules se développent. Pour préparer le modèle, dessinez la surface totale de croissance à l’échelle originale, divisez-la en secteurs égaux et marquez le centre. Pour une boîte de Petri ronde de 8,5 cm de diamètre, cela attribue 14cm2 à une colonie de biofilms. - Faites couver les plaques à 30 °C pendant trois jours. Pendant cette période, les colonies de biofilms se développent et forment une structure tridimensionnelle et ridée.
- Prenez des photos comme à l’étape 1.11.
Tableau 1. Composition finale 1x MSgg utilisée dans cette étude.
| 1,925 mM | Monobase phosphate de potassium |
| 3,075 mM | Dibase phosphate de potassium |
| 100 mM | acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique, pH 7,1 |
| 2 mM | Chlorure de magnésium hexahydraté |
| 700 μM | Chlorure de calcium anhydre |
| 50 μMa | Chlorure de fer(III) hexahydrate |
| 125 μMb |
| 1 μM | Chlorure de zinc anhydre |
| 2 μM | Chlorhydrate de thiamine |
| 50 μg/ml | Tryptophane |
| 50 μg/ml | Phénylalanine |
| 50 μg/ml | Threonine |
| 0,5 % (v/v) | Glycérol anhydre |
| 0,5 % (v/v) | L-glutamique sel monosodique hydrate |
| Apour l’analyse sur pellicule ; bpour le test biofilm |
