Essai de résistance à l’éthanol pour évaluer l’intégrité de la matrice de biofilm

Résumé

Source : Bucher, T., et al. Méthodologies pour l’étude des biofilms de B. subtilis comme modèle de caractérisation des inhibiteurs de biofilms de petites molécules. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo montre comment l’intégrité de la matrice de biofilms influence la résistance bactérienne à l’éthanol en comparant les unités formant des colonies dans des biofilms non traités et perturbés par les inhibiteurs. La réduction des UFC dans les échantillons traités par inhibiteurs démontre que la matrice extracellulaire est essentielle pour protéger les cellules embarquées dans le biofilm contre le stress antimicrobien.

Protocole

1. Analyse de résistance à l’éthanol

1. Faites pousser des biofilms et, après 68 heures de croissance à 30 °C, découpez les colonies de biofilms en deux parties égales à l’aide d’une lame de rasoir et du gabarit.
2. Soulevez soigneusement chaque moitié de la colonie de biofilms de la plaque d’agar avec une petite spatule et déplacez-la vers un tube microcentrifuge de 1,5 ml contenant 500 μl de solution séline tamponnée phosphate (PBS). Si nécessaire, grattez les cellules restantes de la plaque et transférez-les également dans le tube de la microcentrifuge.
   REMARQUE : La seconde moitié de la colonie de biofilms est traitée différemment, selon qu’il s’agisse du témoin ou de la mesure de la résistance aux agents stérilisants.
3. Pour le contrôle, incubez la seconde moitié de la colonie de biofilms dans un PBS de 500 μl. Pour évaluer la résistance aux agents stérilisants, transférez la seconde moitié de la colonie de biofilm à 500 μl d’éthanol à 50 % (v/v).
   REMARQUE : Des agents stérilisants alternatifs tels que l’hypochlorite de sodium peuvent être utilisés. Pour tous les agents stérilisants utilisés, déterminez la concentration active et le temps d’incubation lors d’une expérience préliminaire.
4. Incubez les colonies de biofilm pendant 10 minutes sur le plan de travail à température ambiante.
5. Centrifugez les colonies de biofilm pendant 5 minutes à 18 000 x g et retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajoutez 300 μl de PBS.
6. Sonicez les cellules légèrement (amplitude 10 %, impulsion 5 secondes) avec la micro-pointe d’un sonicateur.
   REMARQUE : L’énergie de sonication doit être suffisante pour séparer les agrégats de biofilms. Cependant, une sonication trop agressive peut lyser les cellules. Confirmez à l’avance par microscopie optique que l’énergie de sonication utilisée ne lyse pas les cellules et que tous les agrégats sont dissous.
7. Ajoutez 700 μl de PBS à un volume final de 1 ml. Effectuer une dilution en série (jusqu’à ^10-7) dans PBS et étaler 100 μl de 3 dilutions sur une plaque d’agar LB-1,5 % à l’aide de billes de verre stériles.
   REMARQUE : Les dilutions optimales à plaquer doivent être déterminées lors d’une expérience préliminaire, car cela dépend du nombre de cellules dans la colonie de biofilm d’intérêt et du taux de survie des cellules en réponse à l’agent stérilisant.
8. Incubez les plaques toute la nuit à 30 °C, comptez l’UFC et déterminez l’UFC/ml. À partir de la CFU/ml finale de chaque demi-colonie de biofilm, calculez le pourcentage de survivants.
   REMARQUE : Lorsqu’elles sont réalisées et analysées comme décrit, les deux moitiés de la colonie de biofilm témoin et la moitié non traitée versus traitée à l’éthanol devraient présenter des différences inférieures à 10 % dans le nombre de cellules viables, vérifiant respectivement la symétrie ou la résistance de la colonie. Alternativement, les résultats peuvent être représentés en CFU total. Le nombre de cellules de la colonie témoin et de la colonie de biofilms non traitée doit rester dans le même ordre de grandeur. En revanche, le nombre de cellules de la moitié traitée à l’éthanol d’une colonie de biofilms traitée à de petites molécules devrait diminuer d’au moins deux ordres de grandeur pour affirmer une sensibilité accrue à l’agent stérilisant.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
Monobase phosphate de potassium	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G
Dibase phosphate de potassium	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique	Fisher Scientific, 209,27 g/mol	BP308-500
Chlorure de magnésium hexahydraté	Merck, 203,30 g/mol	1.05833.0250
Chlorure de calcium anhydre	J.T. Baker, 110,98 g/mol	1311-01
Chlorure de manganèse(II) tétrahydrate	Sigma, 197,91 g/mol	31422-250G-R
Chlorure de fer(III) hexahydrate	Sigma, 270,30 g/mois)	F2877-500G
Chlorure de zinc anhydre	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
Chlorhydrate de thiamine	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-tryptophane	Fisher Scientific, 204,1 g/mol	BP395-100
L-phénylalanine	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-thréonine	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
Glycérol anhydre	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamique acide, les sels monosodiques hydratent	Sigma, 169,11 g/mol	G1626-1KG
D-leucine	Sigma, 169,11 g/mol	855448-10G
Éthanol anhydre	Gadot	830000054
Lame de rasoir	Eddison	NA
Papiers filtrants en cellulose circulaires	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldéhyde	EMS (Electronic Microscopy Science), 25 % dans l’eau	16220
Paraformélélidoïde	EMS, 16 % en eau	15710
Cacodylate de sodium	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Chlorure de calcium 2-hydrate	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Shaker 37 °C	Nouveau-Brunswick Scientifique Innowa42	NA
Centrifugeuse	Centrifugeuse de table Eppendorf 5424	NA
Sonifier numérique, modèle 250, utilisé avec Double Step Microtip	Branson	NA
Incubateur 30 °C	Relieur	NA
Incubateur 23 °C	Relieur	NA
Système de filtre, 500 ml, polystyrène	Cornig Incorporated	NA
Vibrateur rotatif - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA