Préparation des colonies de biofilms bactériens pour l’analyse morphologique

Résumé

Source : Bucher, T., et al., Méthodologies pour l’étude des biofilms de B. subtilis comme modèle pour caractériser les inhibiteurs de biofilms de petites molécules. J. Vis. Exp.(2016)

Cette vidéo montre la préparation de colonies biofilmées bactériennes matures pour l’imagerie haute résolution. Il couvre les étapes de fixation, déshydratation, montage et revêtement métallique afin de préserver et visualiser la morphologie du biofilm.

Protocole

Préparation d’échantillons de colonie de biofilm pour microscopie électronique à balayage

1. Cultivez des colonies de biofilms bactériens.
2. Préparez un nouveau lot de glutaraldéhyde à 2 % (v/v), une solution de paraformaldéhyde à 3 % (v/v) dans 100 mM de cacodylate de sodium, 5 mM de tampon de chlorure de calcium, pH 7,3. Préparez 5 ml de fixateur pour chaque boîte de Petri de 8,5 cm de diamètre.
   ATTENTION : Le glutaraldéhyde et le paraformoldéhyde sont dangereux. Manipulez-les avec un équipement de sécurité à l’intérieur d’une hotte chimique. Jetez les solutions et les matériaux contaminés dans les déchets dangereux.
3. Ajoutez soigneusement le fixateur aux colonies de biofilms, sans le dispenser directement sur les biofilms.
   REMARQUE : En raison du caractère hydrophobe de la colonie de biofilms, les colonies se détachent lentement de l’agar et commencent à flotter.
4. Scellez soigneusement les plaques avec une bande de Parafilm. Incubez sur un shaker rotatif pendant 2 heures à température ambiante, puis transférez les plaques à 4 °C pendant la nuit.
5. Le lendemain, retirez soigneusement le liquide avec une pipette Pasteur reliée à une pompe à vide.
6. Ajoutez soigneusement 10 ml de cacodylate de sodium 100 m, 5 mM de tampon de chlorure de calcium pour laver le biofilm et couver pendant 5 minutes. Retirez doucement le liquide avec la pipette en verre Pasteur du coin de l’assiette pour éviter d’abîmer le biofilm, puis ajoutez une solution de lavage fraîche en pipotetant doucement. Répétez cette étape une fois.
7. Pour la déshydratation des colonies de biofilms, procéder aux étapes suivantes : 2x 5 min dans_{ddH 2}O ; 2x 20 min dans 30 % d’éthanol ; 2x 20 min dans 50 % d’éthanol ; 2x 20 min dans 70 % d’éthanol ; 2x 20 min dans 96 % d’éthanol ; 2x 30 min dans 100 % d’éthanol.
   1. Ajoutez 15 ml de liquide pour chaque boîte de Petri de 8,5 cm de diamètre à chaque étape et retirez le liquide avec soin après chaque incubation.
8. Utilisez l’une des deux méthodes différentes pour sécher les échantillons à partir de l’éthanol.
   1. Pour le séchage à l’air à partir d’éthanol :
      1. Découpez un papier filtre en cellulose (diamètre de 9 cm) en quarts. Immergez brièvement un quart dans 100 % d’éthanol, puis transférez soigneusement une colonie de biofilms flottante dessus. Mettez le papier filtre humide dans une boîte de Petri doublée de papier filtrant. Couvrez la boîte de Petri et laissez sécher les colonies de biofilm toute la nuit dans une hotte chimique.
9. Enduire un moignon de microscopie électronique avec du ruban carbone. À l’aide d’une pince à épiler, transférez soigneusement les colonies de biofilm sur le moignon. Reliez chaque colonie au stub en ajoutant un pont fin en ruban carbone, ce qui est crucial pour l’élimination de la charge sous le faisceau d’électrons. À ce stade, manipulez les colonies de biofilms avec soin car elles sont très fragiles. Conservez les échantillons dans un dessiccateur pendant au moins 24 heures ou jusqu’à l’examen.
10. Le jour de l’examen, avec le microscope électronique à balayage (MEB), on revêt les colonies de biofilm pendant 2 minutes à un angle de 60° dans un sputter-coat en or-palladium. Répétez cette étape deux fois et faites pivoter les échantillons de 120° entre les deux. À la fin, applique un sputter-coappe sur les échantillons pendant 3 minutes à partir du haut. La fine couche de 20 nm d’or-palladium améliore la conductivité et accentue le contraste de l’échantillon pour l’imagerie en microscopie électronique à balayage.
11. Stockez les échantillons dans un dessiccateur pour éviter la réhydratation de l’échantillon jusqu’à l’imagerie au microscope électronique à balayage.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Glycérol anhydre	Bio-Lab Itd	712022300
Éthanol anhydre	Gadot	830000054
Lame de rasoir	Eddison	NA
Papiers filtrants en cellulose circulaires	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldéhyde	EMS (Electronic Microscopy Science), 25 % dans l’eau	16220
Paraformélélidoïde	EMS, 16 % en eau	15710
Cacodylate de sodium	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Chlorure de calcium 2-hydrate	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Fixation en aluminium en contrebas	EMS, tête fente	75230
Ruban adhésif au carbone	EMS	77825-12
Shaker 37 °C	Nouveau-Brunswick Scientifique Innowa42	NA
Incubateur 30 °C	Relieur	NA
Incubateur 23 °C	Relieur	NA
Vibrateur rotatif - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
Microscope électronique à balayage environnemental	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA