Une méthode de verre de couverture à chambre pour la formation in vitro de biofilms bactériens

Résumé

Source : Beaudoin, T., et al. Visualisation des effets des crachats sur le développement du biofilm à l’aide d’un modèle de verre de couverture à chambre. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre l’utilisation d’un verre de couverture à chambre pour étudier l’effet des facteurs de l’héscorte de la mucoviscidose issue du patient sur le développement du biofilm bactérien.

Protocole

Toutes les procédures concernant la collecte d’échantillons ont été réalisées conformément aux directives IRB de l’institut.

1. Méthode du verre de couverture à chambre pour la formation de biofilms
   1. Faites pousser l’isolat bactérien d’intérêt toute la nuit dans le milieu désiré à 37 °C avec secouage (200 tr/min).
      REMARQUE : Plusieurs bactéries différentes ont été utilisées, notamment les isolats cliniques Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia complex et Achromobacter xylosoxidans. Le choix du milieu dépend des souches et des conditions d’intérêt, cependant (bouillon Luria) des milieux LB peuvent être utilisés pour les premières expériences.
   2. À partir de culture nocturne, placez 40 μl de culture dans 4 ml de milieux frais et faites pousser pendant 3-4 heures à 37 °C avec secouage (200 tr/min) pour obtenir une culture avec une densité optique à 600 nm (OD600) d’environ 0,5-0,6.
   3. Diluez la culture de l’étape 1,2 à 1/5 dans le milieu désiré avec un filtrat de crachats à 10 % ou sans filtrat d’expectoration (en témoin). D’autres concentrations de filtrat d’expectorations peuvent être testées (c’est-à-dire 50 % ou 100 %).
   4. Utilisez 200 μl de dilution pour semer les puits de semis des chambres à lames.
   5. Laissez les bactéries s’attacher pendant 4 heures à 37 °C sans secouer.
   6. Après 4 heures, retirez le substrat et lavez doucement le biofilm avec un substrat 1x frais. Remplacez-le par un média frais de 200 μl.
      REMARQUE : Pour étudier les effets des crachats sur le biofilm, le milieu frais doit contenir du surnageant d’expectorations.
   7. Laissez les biofilms croître pendant la durée souhaitée à 37 °C sans secousses, en remplaçant le milieu toutes les 12 heures, sans lavage jusqu’au moment de la microscopie.
      REMARQUE : Pour étudier l’effet des surnadants de l’expectoration sur la susceptibilité aux biofilms antibiotiques, des antibiotiques sont ajoutés au milieu après 24 heures de croissance du biofilm et sont maintenus dans le milieu jusqu’à la coloration et l’imagerie des biofilms.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lab-Tek II Verre de couverture à chambre, borosilicate #1.5, 8 puits	Thermo Sicher Scientific	155409
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Média standard pour la croissance nocturne/croissance de biofilm