Imagerie confocale des biofilms bactériens induits par des filtrats de crachats chez des patients atteints de mucoviscidose kystique

Résumé

Source : Beaudoin, T., et al. Visualisation des effets des crachats sur le développement du biofilm à l’aide d’un modèle de verre de couverture à chambre. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo présente une méthode in vitro pour évaluer comment la mucoviscidose dérivée du patient influence la formation de biofilms bactériens. Grâce à des lames de chambre, à la coloration fluorescente et à la microscopie confocale, elle révèle une épaisseur accrue, une architecture modifiée et une biomasse viable plus élevée dans les biofilms cultivés avec des crachats, soulignant le rôle des composants hôtes dans la formation du développement des biofilms.

Protocole

Toutes les procédures concernant la collecte d’échantillons ont été réalisées conformément aux directives IRB de l’institut.

Biofilms de coloration et microscopie confocale

1. En suivant le temps de croissance souhaité (24-48 heures est le plus optimal), retirez le milieu des puits de chambre et lavez doucement chaque chambre deux fois avec 300 μl de PBS stérile.
2. Préparez le mélange de coloration pour le biofilm en mélangeant 1 μl de chaque colorant (fourni dans le kit de viabilité) pour chaque ml de solution nécessaire. Préparez un colorant dans de l’eau ou une solution de substrat.

REMARQUE : L’eau est recommandée par le fabricant.

3. Ajoutez 200 μl de mélange de colorant à chaque puits de verre de couverture à chambre et incubez à température ambiante, dans l’obscurité pendant 45 minutes.
4. Retirez le mélange de taches des chambres et lavez chaque puits avec 300 μl de PBS stérile. Retirez le PBS et remplacez-le par de l’eau fraîche ou un substrat.
5. Procéder à la visualisation des biofilms via microscopie confocale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lab-Tek II Verre de couverture à chambre, borosilicate #1.5, 8 puits	Thermo Sicher Scientific	155409
Kit de viabilité des biofilms Live/Dead de Filmtracer	Thermo Fisher Scientific	L10316
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Média standard pour la croissance du gowth/biofilm pendant la nuit
Solution physiologique tamponnée au phosphate (Dulbecco A)	Oxoïde	BR0014G	Lavage des chambres de biofilm après le retrait du support
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss