Modéliser l’infection intestinale chez les larves de poisson-zèbre à l’aide de bactéries d’origine alimentaire

Résumé

Source : Flores, E., et al. Utilisation du protozoaire Paramecium caudatum comme véhicule pour les infections alimentaires chez les larves de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo démontre la méthode pour établir un modèle d’infection intestinale bactérienne d’origine alimentaire chez les larves de poisson-zèbre en les nourrissant avec des paramecia infectées par E. coli fluorescent.

Protocole

1. Infection alimentaire du poisson-zèbre
   1. Incubez les bactéries avec Paramecia.
      1. Préparez une co-culture de Paramecium caudatum et d’Escherichia coli MG1655 la veille de l’infection. Combinez 8 mL de milieux E3, 1 mL d’une culture paramécie en cours et 1 mL d’une culture E. coli MG1655 (OD₆₀₀ = 1,0) resuspendus dans 1x E3 dans des flasques de culture tissulaire T25. Incubez les flasques à température ambiante (RT) toute la nuit. Pour chaque condition de traitement, préparez deux flasques de paramecia.
      2. Inoculez le milieu de croissance bactérien (LB (bouillon de lysogenèse) : 1 g/L de tryptone, 0,5 g/L d’extrait de levure, 1 g/L de NaCl) avec la souche infectieuse de bactéries en prélevant une colonie bactérienne individuelle d’une plaque à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile. Incubez la culture liquide à 37 °C et laissez secouer à 110 tours par minute (tr/min) toute la nuit.
         REMARQUE : Un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire et gants) doit être porté, et des installations de biosécurité niveau 2 doivent être utilisées lors de la manipulation d’agents infectieux.
      3. Le lendemain, mesurez le OD₆₀₀ de la culture nocturne. Calculer le volume de culture nécessaire pour obtenir un OD600 de 1 lorsqu’il est resuspendu dans 11 mL de milieu.
      4. Prélever le volume de bactéries par centrifugation à 6 000 g pendant 5 minutes, un volume pour chaque flasque de paramecia. Jetez le surnageant et resuspendez la pellete bactérienne dans 1 mL de milieu E3.
      5. En option, pré-tachez les bactéries avec un colorant fluorescent.
         1. Ajoutez 1 μL de coloration bactérienne FM 4-64FX (solution standard 5 mg/mL). Couvrez le tube avec du papier aluminium pour protéger du photoblanchiment et incubez en tournant de bout en côté à température ambiante (RT) pendant 15 minutes.
         2. Retirez l’excès de colorant en lavant avec 1x E3 : Granulez les bactéries par centrifugation à 6 000 x g pendant 1,5 min, puis remettez le granule dans 1 mL de média E3. Répétez l’étape de lavage deux fois.
         3. Récolter les bactéries colorées par cntrifugation à 6 000 x g pendant 5 minutes. Jetez le surnageant et resuspendez la pellete bactérienne dans 1 mL de milieu E3.
      6. Ajoutez 1 mL de suspension bactérienne à chacun des deux flasques de paramecia fraîche. Incuber au temps récréatif pendant 2 heures.
         REMARQUE : Si vous travaillez avec des bactéries colorées, incubez dans le noir à la RT pendant 2 heures
2. Co-culture bactéries de lavage/paramecia
   1. Combinez le contenu des deux flasques de co-culture paramecia/bactérie dans un tube conique de 50 mL. Centrifugez à échantillonner à 300 x g à 15 °C pendant 10 minutes. Assurez-vous que la centrifugeuse est pré-refroidie avant cette étape.
   2. Retirez environ 10 mL du surnageant E3 à l’aide d’une pipette sérologique et ajoutez environ 10 mL de 1x E3 frais au tube conique.
      REMARQUE : Lors de toutes les étapes de lavage, il est essentiel d’être très rapide lors du retrait du surnageant, car la paramecia commencera à nager hors du pellet. Faites tourner et retirez le surnageant d’un tube à la fois pour assurer une manipulation assez rapide à cette étape, et éviter la perte de paramécie dans le surnageant.
   3. Centrifugez les échantillons à 300 x g à 15 °C pendant 5 minutes. Retirez environ 10 mL du surnageant E3 à l’aide d’une pipette sérologique, puis ajoutez environ 10 mL de 1x E3 frais dans le tube conique. Répétez cette étape deux fois.
   4. Centrifugeuse échantillonne à 300 x g à 15 °C pendant 5 minutes. Retirez environ 10 mL du surnageant E3, en veillant à ne pas perturber la pastille.
   5. Réinjectez le pellet dans les 10 mL restants de milieu E3 et transférez 500 μL de la suspension dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL. Comprimez les 500 μL de paramecia en centrifugant à 300 x g pendant 5 minutes pour compter le nombre de paramecia.
   6. Retirez 400 μL du surnageant E3 de l’échantillon de 500 μL. Ajoutez 20 μL de solution de formaldéhyde à 36,5 % aux 100 μL restants de paramecia, puis resuspendez doucement, puis incubez pendant 5 minutes à 22 °C.
      REMARQUE : Cette étape élimine la paramèce pour permettre le comptage.
   7. Mesurez le volume total réel à l’aide de la pipette et enregistrez. Diluez la suspension paramecia 1:1 v/v avec une solution de bleu de trypan à 0,4 %.
   8. Utilisez un compteur cellulaire ou un hémocytomètre pour compter le nombre de paramécies morts/mL.
      REMARQUE : En raison de l’étape de fixation précédente, la plupart des paramecia seront morts à ce stade, mais ce nombre reflète le nombre de paramecia vivants pour l’expérience de co-incubation. Les auteurs n’ont pas trouvé de décès significatif de paramécie dû à une co-incubation bactérienne, ce qui peut donc être écarté comme un facteur ici.
3. Larves de Paramecia et de poisson-zèbre co-incubées
   1. Calculez la concentration de paramecia dans le tube conique de 50 mL
   2. Calculez le volume de paramecia lavé nécessaire pour une concentration de 2 x 10⁵ paramecia/mL dans un volume final de 3 mL d’E3.
      REMARQUE : La concentration de paramecia peut être ajustée en fonction de la dose bactérienne souhaitée, qui est optimisée.
   3. Anesthésiez le poisson-zèbre en ajoutant de la tricaïne dans un pH tris de 100 mM à 8,0 pour une concentration finale de 100 mg/L. Transférez 10 poissons-zèbres dans chaque puits d’une plaque à 6 puits pour un volume total de 3 mL d’E3 frais contenant la concentration appropriée de paramécie. Veillez à ce que les larves soient transférées dans un liquide minimal afin qu’elles se remettent bien de l’anesthésie dans le receveur.
   4. Incubez à 30 °C pendant 2 heures dans un incubateur diurne en plein jour, afin d’assurer des conditions d’éclairage optimales pour la proie.
   5. Lavez le poisson-zèbre au moins 5 fois en transférant les poissons dans un nouveau puits contenant 3 mL d’E3 frais contenant 100 mg/L de tricaïne à chaque fois.
      REMARQUE : N’essayez pas d’omettre la tricaïne lors de l’étape du lavage. Le transfert de larves mobiles sans anesthésie augmente le risque de dommages et de détresse pour l’animal.
   6. En option, préparez le poisson-zèbre pour l’imagerie en l’intégrant dans 3 mL d’agarose à faible fondu à 1 % dans une plaque à paroi noire à 6 puits : l’agarose à faible fusion est composée en 1xE3 et chauffée au micro-ondes. Une fois fondu, ajoutez la tricaïne à une concentration finale de 160 mg/mL. Placez les poissons sous un stéréomicroscope, en utilisant une pointe de chargement en gel coupé, en vous assurant que la tête est à gauche et la queue à droite (Figure 1). Attendez 5 minutes que l’agarose prenne, puis superposez le poisson incrusté avec 1x E3 contenant 160 mg/mL de tricaïne pour l’imagerie.

Résultats

Figure 1 : Colonisation du poisson-zèbre avec des bactéries. Les poissons-zèbres à 5 dpf ont été laissés non infectés (A) ou colonisés par des neurophobes exprimant (B) E. coli ou (C

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Paramecium caudatum, vivant	Caroline	131554	Non, ne pas stocker les cultures agricoles en dessous de la température ambiante
Solution bleue de Trypan à 0,4 %	Sigma	T8154-20ML	liquide, filtré stérilement, adapté à la culture cellulaire ; préparé dans 0,81 % de chlorure de sodium et 0,06 % de phosphate de potassium, dibasique
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma	276855-100ML	Conserver dans une armoire de sécurité à solvants
Escherichia coli, MG1655	ATCC	700926 ATCC	peut être remplacée par toute autre souche d’E. coli non pathogène
Teinture FM 4-64FX	Thermo Fisher	F34653	Aliquot et Magasin Congelés
Formaldéhyde	Sigma	F8775-4X25ML
LB Bouillon	Sigma	L3397-1KG
Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate	Thermo Fisher	18912014
Tétracycline	Sigma	87128-25G	toxique, irritant
Tricaïne (méthanassulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate)	Sigma	E10521-10G
Triton X-100	Sigma	X100-100ML
Solution Trypan Blue, 0,4 %	Sigma	93595-50ML
Agarose à point de fusion UltraPure à bas niveau	Thermo Fisher	16520050
Hémocytomètre ou compteur cellulaire	Aucun
Stéréomicroscope	Aucun
Centrifugeuse à table
Micro-ondes
Roue rotatrice
Incubateur chauffant à secouage
Installations aquatiques
Aquariums d’élevage