Développement d’un biofilm monocouche bactérien à l’aide d’un réacteur électrochimique

Résumé

Source : Tokunou, Y. et al., Détection électrochimique de l’effet isotopique cinétique du deutérium sur le transport extracellulaire d’électrons chez Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’assemblage et le fonctionnement d’un modèle de réacteur électrochimique conçu pour simuler la formation de biofilms sur les surfaces d’électrodes. La stimulation électrochimique contrôlée favorise l’adhésion microbienne, conduisant au développement progressif d’un biofilm bactérien monocouche.

Protocole

1. Construction d’un réacteur électrochimique à trois électrodes (Figure 1)
   1. Placez un substrat dopé à l’oxyde d’indium (ITO) comme électrode de travail au fond du réacteur.
   2. Ensuite, insérez un cylindre en verre (diamètre de 2 cm) et un couvercle en polytétrafluoroéthylène (PTFE). Ensuite, insérez dans le réacteur un fluorure d’argent/argent (Ag/AgCl) (chlorure de potassium, saturé en KCl) et un fil de platine comme électrodes de référence et contre-électrodes, respectivement.
      REMARQUE : Pour éviter les fuites d’air et de solution, insérez une feuille de caoutchouc butyle entre chaque composant.
   3. Ajoutez 4,0 mL de milieu défini (DM) complétés avec 10 mM de lactate et 0,5 g/L d’extrait de levure dans le réacteur électrochimique.
   4. Après avoir confirmé qu’il n’y a pas de fuite du réacteur électrochimique, faites circuler le gaz azoté dans le réacteur électrochimique pendant 20 minutes pour maintenir des conditions anaérobies à l’intérieur du réacteur électrochimique.
      REMARQUE : Pour éviter la contamination par d’autres microbes, le gaz doit être filtré avant de s’écouler vers le réacteur électrochimique.
   5. Connecter le réacteur électrochimique à un potentiostat et appliquer +0,4 V (contre l’électrode à hydrogène standard, SHE) à l’électrode ITO, en maintenant la température du réacteur électrochimique à 30 °C grâce à un système de circulation d’eau externe.
      REMARQUE : Pour éviter l’effet d’un champ électrique externe, le réacteur électrochimique doit être placé dans une cage de Faraday.
2. Culture électrochimique des cellules MR-1 de S. oneidensis (Figure 1 et Figure 2)
   1. Ajustez la densité cellulaire de la suspension obtenue à l’étape 1.1 à une densité optique de 1,43 à 600 nm (_{DO 600}) avec de la DM complétée par 10 mM de lactate et 0,5 g/L d’extrait de levure.
      REMARQUE : Pour obtenir le bon OD₆₀₀, appliquez la suspension cellulaire de OD₆₀₀ ≤ 0,8 à un spectromètre UV-vis avant d’ajuster OD₆₀₀ à 1,43.
   2. Ajoutez 0,3 mL de suspension de la cellule dans le réacteur électrochimique via le port d’injection à l’aide d’une seringue : le OD₆₀₀ du réacteur passe à 0,1.
      REMARQUE : L’ajout d’une suspension de cellules de 0,3 mL avec un OD₆₀₀ = 1,43 dans un réacteur électrochimique contenant un milieu de 4,0 mL donne 4,3 mL de solution avec un OD₆₀₀ = 0,1. Lorsqu’on utilise d’autres réacteurs de volumes différents, le calcul de la densité de la cellule est nécessaire.
   3. Poursuivre l’application potentielle à +0,4 V (contre SHE) sur l’électrode ITO pendant 25 heures.
      REMARQUE : Pour la formation d’un biofilm monocouche sur une électrode ITO, assurez-vous que le courant produit présente une déviation inférieure à 50 % de la Figure 2.

Résultats

Figure 1 : Réacteur électrochimique utilisé dans cette étude. Photographie de la cellule électrochimique avant la construction (a) et après la construction (b). (c) Illustration schématique du réacteur électrochimique après 25 h d’inoculation électrochi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cylindre en verre	N/A	N/A	Fabriqué sur mesure, utilisé comme réacteur électrochimique
Couverture et base en PTFE	N/A	N/A	Sur mesure, utilisé comme couverture et fondation du réacteur électrochimique
Caoutchouc de buthyle	N/A	N/A	Fabriqué sur mesure, inséré entre chaque composant du réacteur électrochimique
Septa	GL Science	3007-16101	Utilisé comme port d’injection d’un réacteur électrochimique
Électrode à oxyde dopé à l’indium (ITO)	GEOMATEC	N°0001	Utilisé comme électrode de travail, 5Ω/sq
Électrode saturée en KCl en Ag/AgCl	HOKUTO DENKO	HX-R5	Utilisé comme électrode de référence, Φ0,30 mm
Fil de platine	La Corporation-Nilaco	PT-351325	Utilisé comme contre-électrode
Luria-Bertani (LB) Bouillon, Meunier	Becton, Dichkinson and Company	244620	Milieu pour la préculture de S. oneidensis MR-1
Bacto agar	Becton, Dichkinson and Company	214010
NaHCO₃	Wako	191-01305	Utilisé pour un milieu défini (DM)
CaCl₂·2H₂O	Wako	031-00435	Utilisé pour le DM
NH₄Cl	Wako	011-03015	Utilisé pour le DM
MgCl₂·6H₂O	Wako	135-00165	Utilisé pour le DM
NaCl	Wako	191-01665	Utilisé pour le DM
2-[4-(2-hydroxyéthyle)-1-piperazinyl] acide éthanassulfuronique (HEPES)	DOJINDO	346-08235	Utilisé pour le DM
Sodium Lactate Solution	Wako	195-02305
Extrait de levure bacto	Becton, Dichkinson and Company	212750
Oxyde de deutérium (D, 99,9 %)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-PK	Additif pour les expériences d’effet isotopique cinétique
Incubateur	TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	Utilisation pour la préculture
Shaker	TAITEC	NR-3	Utilisation pour la préculture
Machine à autoclave	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Utilisé pour la stérilisation du réacteur électrochimique et du milieu
Développé couché propre	SANYO	MCV-91BNF	Utilisé pour prévenir la contamination du réacteur électrochimique et du milieu par d’autres microbes
Séparateur centrifugeuse	Eppendorf	5430R	Une vitesse de rotation allant jusqu’à 6000×g est requise
Générateur de gaz azote	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	Une bouteille de gaz azoté peut également être utilisée à la place du générateur à gaz
Spectromètre à vis-UV	SHIMADZU	UV-1800	Utilisé pour l’optimisation de la densité cellulaire
Potentiostat	BioLogic	VMP3	Utilisé pour la formation de biofilms et les expériences sur l’effet isotopique cinétique
Circulateur d’eau thermale	EN UN SEUL	TR-1A	Utilisé pour le maintien de la température d’un réacteur électrochimique
Cage de Faraday	HOKUTO DENKO	HS-201S	Utilisation pour des expériences électrochimiques