Visualisation du stress oxydatif induit par un pathogène chez C. elegans à l’aide de SKN-1 marqué GFP

Résumé

Source : Naji, A., et al. Étude du stress oxydatif causé par les streptocoques du groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre l’utilisation de SKN-1 marqué par une protéine fluorescente verte chez C. elegans pour surveiller le stress oxydatif en suivant la fluorescence verte. Les vers exposés à S. gordonii présentent une forte fluorescence nucléaire, confirmant un stress induit par les agents pathogènes, tandis que ceux nourris avec E. coli présentent une fluorescence verte diffuse dans le cytoplasme, indiquant une activation minimale de SKN-1.

Protocole

1. Observation de la localisation du SKN-1 en réponse à l’infection par Streptococcus gordonii

1. Ajouter ~100 larves L4 à chaque extrait de levure Todd–Hewitt (THY) ensemencé avec Streptococcus et à chaque plateau d’agar du milieu de croissance nématode (NGM) ensemencé d’Escherichia coli (E. coli). Utilisez trois plaques par souche de bactérie. Incubez les plaques pendant 2 à 3 heures à 25 °C.
2. Ensuite, retirez les plaques de l’incubateur, lavez-les avec un tampon M9 modifié (M9W), et collectez les vers dans des tubes coniques de 15 mL.
3. Lavez les vers 3 fois.
4. Retirez la majeure partie du M9W par aspiration et ajoutez 500 μL de M9W contenant 2 mM d’azide de sodium ou 2 mM d’hydrochlorure de tétramisole au granule de ver. Cela anesthésiera les vers, garantissant qu’aucun mouvement n’ait lieu lors de l’observation au microscope.
   ATTENTION : Utilisez un équipement de protection individuelle (EPI) lors de la manipulation de l’azide de sodium. Préparez la solution d’azide sous une hotte chimique.
5. Incubez les granulés de ver à température ambiante (RT) pendant 15 minutes. Ensuite, placez 15 μL de la suspension à vis sur un coussinet d’agarose préparé. Placez délicatement une gaine de couverture n°1,5 sur le coussinet d’agarose contenant les vers anesthésiés.
6. À l’aide d’un microscope fluorescent, visualisez la localisation du facteur de transcription 1 de la famille Skinhead, ou SKN-1 :GFP (SKN-1 marqué par la protéine fluorescente verte) en utilisant les filtres fluorescéine isothiocyanate (FITC) et 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Vers d’image à des grossissements 10x et 20x.
7. Notez les vers en fonction du niveau de localisation de SKN-1. Aucune localisation nucléaire, la localisation de SKN-1B/C ::GFP (ISOFORME SKN-1 MARQUÉE PAR LA PROTÉINE FLUORESCENTE VERTE B/C) dans l’antérieur ou l’arrière du ver, et la localisation nucléaire de SKN-1B/C ::GFP dans toutes les cellules intestinales sont classées respectivement en niveaux de localisation faible, moyen et élevé.
8. Après avoir noté les micrographies fluorescentes, déterminez les différences statistiques par le chi-carré et les tests exacts de Fisher à l’aide d’un logiciel statistique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Médias et produits chimiques
BD Bacto bouillon Todd Hewitt	Fisher Scientific	DF0492-17-6
Tubes centrifugeuses stériles coniques en polypropylène de 15 mL	Fisher Scientific	12-565-269
Azidée de sodium	Sigma Aldrich	S2002-25G
Chlorhydrate de tétramisole	Sigma Aldrich	L9756
Coulisses de couvercle n°1.5 18 mm x 18 mm	Fisher Scientific	12-541A
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C :GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell