Préparation d’un modèle d’aspiration oropharyngée murine pour établir les infections bactériennes des poumons

Résumé

Source : Nielsen, T. B., et al., Modèle d’aspiration oropharyngée murine de pneumonie bactérienne associée au ventilateur et d’acquisition hospitalière. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre la procédure consistant à acheminer des bactéries à travers l’oropharynx jusqu’aux poumons d’une souris anesthésiée afin d’induire une infection pulmonaire et de déclencher une réponse immunitaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Inoculation/infection des souris

1. Suspendre une souris anesthésiée, la suspendant par ses incisives supérieures à un fil fin et solide (par exemple, du fil dentaire) fixé à un objet fixe à une hauteur environ deux fois la longueur du corps de la souris (par exemple, 20 cm) au-dessus de la surface d’opération (par exemple, un établi de laboratoire).
2. Retirez doucement la langue de la souris de sa bouche à l’aide de pinces stériles à extrémité émoussée. Transférez la langue sur un doigt ganté stérile pour éviter qu’elle ne s’écrase accidentellement la langue de la souris. Maintenez la langue à l’extérieur de la bouche, permettant l’accès à l’oropharynx et empêchant la déglutition de l’inoculum sur le côté.
3. En tenant la langue de la souris, placer l’inoculum de 50 μL (suspension bactérienne) dans l’oropharynx à l’aide d’une micropipette ; L’oropharynx se trouve à la jonction de la cavité buccale et du pharynx, vers l’arrière de la bouche.
   REMARQUE : Il est très important de ne livrer le liquide qu’en pipettant jusqu’au premier arrêt de la micropipette. La souris cesse de respirer pendant quelques secondes lorsque l’inoculum est placé dans l’oropharynx ; Finalement, l’aspiration réflexe pousse la souris à inhaler la suspension bactérienne, ce qui est indiqué par le crépitement caractéristique du liquide entrant dans les poumons, ce qui entraîne une infection pneumonique.
4. Si l’inoculum n’est pas placé suffisamment en arrière pour bloquer la respiration normale, pincez les narines avec une pince pour forcer l’aspiration réflexe par la bouche et l’inhalation ultérieure de l’inoculum.
5. Après l’inoculation, libérez la langue, retirez la souris de la ficelle de suspension, placez-la dans une cage et surveillez-la jusqu’à son réveil de l’anesthésie.

2. Surveillance de la progression de la maladie

REMARQUE : En raison de la souffrance animale, divers indicateurs doivent être utilisés pour indiquer quand les souris deviennent moribundes ; l’euthanasie doit être réalisée après cette détermination, conformément à un protocole IACUC préalablement approuvé ; divers marqueurs de la moribundité incluent la température corporelle, la perte de poids, l’apparence, la démarche et d’autres biomarqueurs pouvant être obtenus à partir du sang (par exemple, via iSTAT).

1. Euthanasiez les souris selon le protocole IACUC précédemment approuvé (par exemple, CO₂ suivi d’une luxation cervicale).
2. Retirez les poumons d’une souris euthanasiée en coupant la trachée, l’artère pulmonaire et la veine pulmonaire près des poumons.
   1. Microscopie
      1. Placez les poumons (ou une partie) dans un moule à échantillon.
      2. Remplir le moule de l’échantillon avec un composé optimal de température de coupe (O.C.T.), en submergeant complètement le tissu.
      3. Congelez l’échantillon à -80 °C.
      4. Envoyez l’échantillon dans un laboratoire de pathologie pour le faire césiter et le monter sur des lames pour microscopie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chambre d’anesthésie	Kent Scientific Corporation	VetFlo-0720	Peut accueillir jusqu’à 5 souris
Cryomoule, taille intermédiaire	Sakura Tissue-Tek	4566	Moules en vinyle jetables, 15×15×5 mm
Fil dentaire	Oral-B	37000469537	Attache à un poteau stable à environ 6" au-dessus de la hauteur de la table
Pinces	VWR	82027-440	Autrefois, il retirait doucement la langue de la bouche de la souris
Isoflurane pour l’anesthésie	Abbott	10015516	Un médicament alternatif peut être utilisé ; Modifier la procédure en conséquence
Cartouche iSTAT	Abbott	03P79-25	Différentes cartouches sont disponibles pour répondre à vos besoins
Kétamine, 100 mg/mL	Approvisionnement médical de l’Ouest	4165	Diluez 1:10 en PBS à 1 mg/mL et combinez avec la Xylazine à 1 mg/mL
Pommade pour les yeux	Akorn	Larmes renouvelées	Évitez de toucher l’œil avec la pointe du distributeur
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)	Corning	21-031-CM	PBS de Dulbecco sans calcium ni magnésium
Pointes de pipette, 200 μL	VWR	10017-044	Autoclave avant utilisation
Pipetter, 200-μL	Gilson	Pipetman P200	Autoclave et calibration avant utilisation
Propagateur, cellule bactérienne	Bel-Art	F377360006	Stérilisez par cuit ou autoclav avant chaque utilisation
Fiole, cryogénique, 2,0 mL	Corning	430659	Utilisé pour le stockage cryogénique d’inocules bactériens concentrés