Traitement activé par la lumière des biofilms bactériens à l’aide d’un précurseur photosensible

Résumé

Source : Zhao, K., et al. Un modèle in vitro pour étudier l’effet de la thérapie photodynamique médiée par l’acide 5-aminolevulinic sur le biofilm de Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)

La vidéo présente un protocole de thérapie photodynamique pour évaluer les effets antibactériens sur les biofilms bactériens Gram-positifs. Les biofilms sont divisés en quatre groupes : deux reçoivent un précurseur photosensible, et deux reçoivent un tampon. Tous sont incubés dans l’obscurité, suivis d’une exposition à la lumière rouge à un groupe traité par un précurseur et un groupe uniquement tampon. Les espèces réactives de l’oxygène ne sont générées que dans le groupe recevant à la fois le précurseur et la lumière, ce qui entraîne la mort bactérienne des cellules. La viabilité est comparée entre tous les groupes afin d’évaluer l’efficacité du traitement.

Protocole

1. Formation du biofilm

1. Formation de biofilms dans des microplaques à 96 puits
   1. Récupérez la souche de Staphylococcus aureus USA300 et 3 souches cliniques formant des biofilms (C1-C3) stockées à -80 °C.
      REMARQUE : La capacité des souches cliniques à former des biofilms a été déterminée par le test de la plaque micro-titer.
   2. Inoculez la bactérie dans un milieu de bouillon de soja tryptone (TSB) de 5 mL, puis cultivez dans un incubateur avec des secouements à 37 °C toute la nuit jusqu’à la phase stationnaire.
   3. Centrifugez la culture bactérienne toute la nuit à 4 000 × g pendant 10 minutes à 25 °C et jetez le surnageant. Resuspendez les granulés dans une solution saline tamponnée phosphate (PBS) à une concentration finale de 2,0 × 10 unités formant 9 colonies (UFC)/mL.
      REMARQUE : La concentration de la bactérie a été estimée en mesurant la densité optique et déterminée par le nombre de plaques, révélant que 1 OD₆₀₀ de suspension contenait 1,5 × 10⁸ UFC/mL.
   4. Diluez la suspension bactérienne à 1:200 (1,0 × 10⁷ UFC/mL) dans un milieu TSB contenant 0,5 % de glucose. Inoculez 200 μL de suspension bactérienne dans chaque puits d’une microplaque de polystyrène traitée en culture cellulaire à 96 puits.
   5. Incubez la microplaque statiquement à 37 °C pendant 24 heures dans un environnement bien oxygéné.
      REMARQUE : Le temps d’incubation pour la formation de biofilms matures peut varier selon les souches bactériennes ; cela doit être déterminé avant l’expérience de thérapie photodynamique (PDT).
   6. Jetez le substrat dans les puits et lavez doucement les puits de microplaques avec du PBS trois fois, puis jetez le surnageant.
      REMARQUE : L’étape doit être effectuée très doucement pour éviter de perturber le biofilm formé.

2. Irradiation lumineuse

1. Conservez l’acide 5-aminolevulinique (5-ALA) dans un réfrigérateur à 4 °C. Avant l’expérience, diluez le 5-ALA avec PBS à 10 mM.
   REMARQUE : La solution 5-ALA doit être fraîchement préparée avant l’expérience.
2. Dans le groupe expérimental, ajoutez 200 μL d’ALA de 10 mM à chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de culture. Couvrez l’assiette/plat avec du papier aluminium, puis faites couper pendant 1 heure. Ensuite, irradiez la plaque/antenne avec une diode électroluminescente (LED) d’une intensité lumineuse de 100 mW/^cm2 pendant 1 heure afin d’obtenir une dose lumineuse de 360 J/^cm2 à une longueur d’onde majeure de 633 ± 10 nm.
   REMARQUE : Pour permettre à l’énergie lumineuse d’être livrée efficacement et équitablement au biofilm dans tous les puits/antennes, fixez la distance entre le pic de la source lumineuse et le puits ou l’antenne à 6,0 cm, et limitez la région expérimentale à la zone centrale d’irradiation (10 cm × 8 cm). Pour garantir la reproduction des résultats, les expériences doivent être réalisées à la même température ambiante. Lors de l’étape d’irradiation LED, pour éviter l’exposition directe de la plaque à d’autres sources lumineuses, telles que la lumière du soleil, l’éclairage de la pièce ou la lampe, la LED était allumée avant de déplacer la plaque/antenne vers la zone d’irradiation, et la lumière était suffisamment forte pour terminer l’opération.
3. Mettez en place les groupes témoins (trois groupes témoins ont été mis en place dans notre expérience).
   1. Pour le premier groupe témoin (ALA-LED-), ajouter 200 μL de PBS à chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de culture. Couvrez l’assiette/la plaque avec du papier aluminium, puis faites couver-la pendant 2 heures.
   2. Pour le second groupe témoin (ALA+LED-), ajoutez 200 μL d’ALA de 10 mM à chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de culture. Couvrez l’assiette/la plaque avec du papier aluminium, puis faites couver-la pendant 2 heures.
   3. Pour le troisième groupe témoin (ALA-LED+), ajoutez 200 μL de PBS à chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de culture. Couvrez l’assiette/le plat avec du papier aluminium et laissez-le couver pendant 1 heure. Ensuite, exposez la plaque à la LED avec une irradiation lumineuse de 360 J/^{cm 2} à une longueur d’onde majeure de 633 ± 10 nm.
      REMARQUE : Lors de l’étape de l’irradiation LED, évitez l’exposition directe de la plaque à d’autres sources lumineuses, telles que la lumière du soleil, l’éclairage de la pièce ou la lumière d’une lampe.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bouillon de soja à la tryptone (TSB)	OXOÏDE	CM0129B
SYTO9	Thermo Fisher Scientific	L7012	Les kits de viabilité bactérienne LIVE/DEAD de BacLight
Iodure de propidium (PI)	Thermo Fisher Scientific	L7012	Les kits de viabilité bactérienne LIVE/DEAD de BacLight
Acide 5-aminolévulinique (ALA)	Fudan Zhangjiang Bio-Pharm	3.1
Staphylococcus aureus souche USA300			Références USA 300
Souches cliniques de Staphylococcus aureus (C1-C3)			Toutes les souches cliniques ont été isolées chez des patients atteints de rhinosinusite chronique
Microplaques à 96 puits	Corning Inc	3599	Microplaques en polystyrène à fond plat transparent traitées TC, enveloppées individuellement, avec couvercle, stériles
Microcentrifugeuse Eppendorf 5417	Eppendorf	Z365998 | SIGMA
Incubateur	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000	Shakers orbitaux MaxQ 4000 de table
Diode électrolumineuse (LED)	Technique optique et électronique Wuhan Yage CO	LED-IB