Préparation d’échantillons et imagerie de bactéries marquées par fluorescence

Résumé

Source : Chetrit, D., et al. Application de l’imagerie à cellules vivantes et de la tomographie cryo-électronique pour résoudre les caractéristiques spatiotemporales du système de sécrétion dot/icm de Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo montre la préparation et l’imagerie de bactéries pathogènes marquées par fluorescence. Les tampons d’agarose sont d’abord préparés et positionnés dans un cadre adhésif. Une suspension de bactéries génétiquement modifiées exprimant une protéine fluorescente est appliquée sur le pad pour immobiliser les cellules. Le cadre est ensuite scellé avec une housse et observé au microscope pour capturer des images de fluorescence des bactéries.

Protocole

REMARQUE : Toutes les procédures impliquant la croissance, la manipulation et l’imagerie de L. pneumophila doivent être réalisées dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2, conformément aux directives locales.

1. Insertion de sfGFP dans le chromosome Legionella pneumophila en utilisant l’échange allélique et la stratégie de double sélection (Figure 1, Figure 2)

1. Clonez dans le vecteur de remplacement génique pSR47S11 la séquence suivante : la séquence 1 000 pb en amont du site d’intérêt, puis la séquence sfGFP, puis la séquence 1 000 pb en aval du site d’intérêt (Figure 1). La séquence sfGFP doit être placée dans le référentiel des extrémités N-terminales ou C-terminales avec un liaison contenant quatre à huit acides aminés. Transformez le vecteur résultant en Escherichia coli DH5αλpir. Ensuite, traînez L. pneumophila (le receveur) pour des colonies uniques sur une agar d’extrait de charbon et levure (CYE) contenant 100 μg/mL de streptomycine et cultivez pendant 5 jours à 37 °C (Figure 2).
2. Tracez L. pneumophila sous CYE-agar-streptomycine et faites pousser pendant 2 jours à 37 °C (zone épaisse). Streak E. coli DH5α transformé avec le plasmide auxiliaire pRK600 (helper) sur une agar LB contenant 25 μg/mL de chloramphénicol. Rayez l’E. coli DH5αλpir (donneur) sur de l’agar LB contenant 50 μg/mL de kanamycine.
3. Effectuer l’accouplement triparental : incuber une colonie de l’assistant, une colonie du donneur et du receveur en superposant des plaques des trois souches sur une plaque agar CYE sans sélection et en incubant pendant 4 à 8 heures à 37 °C. En tant que témoins négatifs, incubez un mélange de souche aide+receveur et un mélange donneur+receveur pour les mêmes périodes.
4. Résuspendez les réactions d’accouplement dans 500 μL de plaque_{ddH 2}O. Plaques 20 μL et 50 μL des réactions sur l’agar CYE contenant 100 μg/mL de streptomycine et 10 μg/mL de kanamicine, puis cultivez pendant 5 jours à 37 °C. Tracez quatre des clones résultants sur une agar-choc CYE contenant 100 μg/mL de streptomycine et faites pousser pendant 5 jours à 37 °C.
5. Tracez 16 clones sur de l’agar CYE contenant 5 % de saccharose et 100 μg/mL de streptomycine et cultivez pendant 5 jours à 37 °C. Ensuite, traquez 32 de ces clones sur de l’agar CYE contenant 100 μg/mL de streptomycine et sur un agar CYE contenant 100 μg/mL de streptomycine et 10 μg/mL de kanamycine, puis faites pousser pendant 5 jours à 37 °C.

2. Isolement des clones ayant intégré la sfGFP dans le chromosome L. pneumophila

1. Les clones de stries sensibles à la kanamycine sur plaques CYE-agar-streptomycine confirment l’insertion de sfGFP dans le chromosome par réaction en chaîne par polymérase coloniale (PCR). Utilisez des amorces complémentaires au gène sfGFP et à la région chromosomique d’intérêt pour amplifier la jonction d’insertion.
   1. Mélangez 0,5 μL de chacune des solutions d’amorces de 10 μM et une colonie jusqu’à un volume final de 12,5 μL et dénaturez pendant 10 minutes à 95 °C. Laissez refroidir sur glace pendant 10 minutes, ajoutez 12,5 μL de 2x solution de mélange maître PCR, puis effectuez une analyse PCR.
2. Faire pousser des plaques épaisses des colonies isolées sur des plaques CYE-agar et streptomycine pendant 2 jours à 37 °C. Examiner les niveaux d’expression et la stabilité des fusions sfGFP en immunoblottant avec un anticorps anti-GFP.

3. Imagerie cellulaire vivante de L. pneumophila avec des composants Dot/Icm marqués par fluorescence

1. Préparation des coussinets d’agarose
   1. Préparez environ 30 mL d’une solution d’agarose à faible fondu à 1 % dans de l’eau. Faites chauffer dans une flasque en verre pendant environ 90 secondes, en tourbillonnant de temps en temps, jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissous.
   2. Placez deux lames en verre de 22 x 22 x 0,15 mm³ sur le bord d’une culasse^{en verre} 3 de 25 x 75 x 1,1 mm, l’une sur l’autre. Empilez deux autres lames en verre de 22 x 22 x 0,15 mm³ sur l’autre bord.
   3. Pipeter environ 1 mL d’agarose en fusion dans la lame centrale entre les deux lames supérieures en verre, puis placer une^{autre lame de} 25 x 75 x 1,1 mm 3 sur l’agarose fondue. Essayez d’éviter la formation de bulles d’air. Refroidissez les lames à 4 °C pendant 15 minutes.
   4. À l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir, découpez délicatement le tampon en petits carrés, ~5 x 5^{mm 2}. Fixez un cadre adhésif double face de 17 x 28 x 0,25 mm³ sur une glissière en^verre de 25 x 75 x 1,1 mm 3 et placez plusieurs coussinets sur la glissière.
2. Acquisition d’images
   REMARQUE : Les étapes suivantes sont décrites pour un microscope sous le contrôle de SlideBook 6.0 et équipé d’illuminateurs à semi-conducteurs, d’une caméra CCD monochrome et d’un objectif 100x (ouverture numérique 1,4). Si nécessaire, utilisez des dispositifs de microscopie alternatifs avec des configurations matérielles et logicielles appropriées, personnalisables selon les paramètres du protocole.
   1. Dissoudre une épaisse plaque de L. pneumophila dans 1 mL de ddH_2O, le vortex et la pipette 2–3 μL de dilution sur les tampons. Placez doucement un cache-couvercle de⁵⁰ x 24 x 0,15 mm 3 sur le cadre adhésif.
   2. Dans la fenêtre de capture, ajustez le ND à 180. Ajustez le binning à 2×2 et utilisez le canal de 488 nm pour exposer l’échantillon entre 500 et 1 000 ms. Validez la spécificité du signal de fluorescence en imageant L. pneumophila non marqué avec les mêmes paramètres (Figure 3).

Résultats

Figure 1 : Aperçu schématique de la recombinaison homologue et de l’échange allélique utilisés pour insérer sfGFP dans le chromosome L. pneumophila.(A) Un accouplement triparental a été réalisé entre une so...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Objectif 100x Plan Apo (1.4 NA)	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
Charbon actif	Sigma-Aldrich	C5510
Agarose GPG/LMP, faible fusion	Bioanalytique américaine	AB00981
Agar bacto déshydraté	BD	214010
Cadre génétique, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Scientific	AB-0578
L-cystéine	Sigma-Aldrich	C7352
Lames de couverture de microscope 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Lames de couverture de microscope 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Lames de microscope 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Innovations en imagerie intelligente
Moteur léger Spectra X	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
Extrait de levure	BD	212750