Établissement d’un modèle murin de l’infection à Clostridium difficile

Résumé

Source : Winston, J. A., et al. Modèle murin traité par Cefoperazone de souche cliniquement pertinente de Clostridium difficile R20291. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre la procédure d’inoculation des souris pré-traitées par antibiotiques avec des spores de Clostridium difficile afin d’établir un modèle murien d’infection pour étudier la pathogenèse et les réponses de l’hôte.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de l’inoculum à spores de Clostridium difficile et de la bouche buccale des souris

REMARQUE : Les souris confrontées à des spores de C. difficile doivent être hébergées dans un centre de biosécurité de niveau 2.

1. Obtenir un stock de spores de C. difficile de la souche désirée (dans ce cas, R20291) préparé et stocké à 4 °C dans de l’eau stérile. Déterminez l’énumération de ce stock de spores avant utilisation.
2. En fonction de la concentration connue (spores/ml) du stock de spores, calculez la dilution souhaitée pour obtenir 10⁵ spores par 25 μl. Assurez-vous que le volume de l’inocule est suffisant pour inoculer toutes les souris de l’expérience (25 μl par souris), effectuer l’énumération de l’inoculum (environ 30 μl) et tenir compte de l’erreur de pipetage.
3. Vortex : le stock original de spores de C. difficile . Ensuite, il faut resuspendre le volume calculé (à partir de l’étape 1.2) du stock de spores C. difficile d’origine dans de l’eau stérile à l’intérieur d’un tube de microcentrifuge à bouchon vissé. Effectuez cela aérobie dans une hotte à flux laminaire. Identifiez ce mélange dilué comme « inocule spore ».
4. Placez l’inoculum à spores dans un bain marie à 65 °C et chauffez-le pendant 20 minutes.
   REMARQUE : Cette étape garantira que seules les spores actives de C. difficile restent après le traitement thermique.
5. Dans la hotte à flux laminaire, prenez 50 μl d’inocule à spores chauffés, placez-les dans un tube stérile de microcentrifuge, puis faites-le passer dans la chambre anaérobie. Utilisez cet échantillon pour l’énumération des spores.
6. À l’intérieur de la cagoule à flux laminaire, chargez l’inoculum de spore chauffé restant dans une seringue de 1 ml fixée à une aiguille gastrique stérile à bout de bulbe. Utilisez un seringue à pas à pas manuel pour garantir une dose précise et rapide entre les souris. Assurez-vous que l’aiguille du gauche est remplie avec l’inoculum à spores chauffé avant utilisation.
   REMARQUE : Une nouvelle aiguille stérile à gavage n’est pas nécessaire pour chaque souris. Cependant, si différentes doses de spores de C. difficile sont administrées, une nouvelle aiguille de Gavage est recommandée pour chaque dose.
   REMARQUE : Les spores de C. difficile sont très résistantes aux désinfectants traditionnels. Par conséquent, l’utilisation d’un désinfectant sporicide, tel que le désinfectant sporicide #62 Perisept, est nécessaire. Le fabricant recommande un temps de contact de 2 minutes pour détruire les spores de C. difficile .
7. On obtient chaque souris avec 25 μl de l’inocule sporique. Attachez doucement chaque souris en saisissant l’animal par la peau lâche du cou et du dos afin d’immobiliser la tête. Utiliser l’index immobilise davantage la tête de l’animal et allonge l’œsophage. Assurez-vous que l’animal ne vocalise pas et ne montre pas d’autres signes de détresse pendant la retenue.
   REMARQUE : Le volume total donné aux souris par le gavage ne doit pas dépasser 10 ml/kg de poids corporel (0,1 ml/10 g).
8. Maintenez la souris en position verticale et verticale et passez doucement l’aiguille de la bouche dans le côté de la bouche. Dirigez l’aiguille de gavage le long du palais et avancez lentement l’aiguille vers l’œsophage.
   REMARQUE : Si une résistance est rencontrée, l’aiguille de gavage peut pénétrer dans la trachée et ne doit donc PAS être avancée, mais plutôt retirée et repositionnée immédiatement.
9. Après que l’aiguille de gavage soit à peu près à mi-chemin dans l’œsophage, injectez 25 μl de l’inoculum de spore chauffé et retirez doucement l’aiguille de gavage de l’œsophage.
   REMARQUE : L’avance brusque de l’aiguille de gavage peut entraîner la rupture de l’œsophage ou de l’estomac. Par conséquent, si une résistance est rencontrée lors de l’avancement de l’aiguille à garde, il est préférable de retirer et de repositionner immédiatement l’aiguille à gavage.
10. Remet l’animal dans sa cage et observe-le pour détecter toute toux ou signe de détresse respiratoire, car cela peut indiquer une administration trachéale involontaire ou une aspiration de l’inocule chauffé de la spore.
    REMARQUE : Les souris sont extrêmement sensibles à C. difficile après un traitement antibiotique ; Par conséquent, des précautions pour éviter la contamination croisée entre cages sont essentielles. C’est particulièrement important lorsqu’on gère des souris traitées par antibiotiques mais non contestées en tant que témoins.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nettoyant désinfectant sporicidial #62 Perisept	SSS Navigator	48027	Ce produit nécessitera une dilution comme recommandé par le fabricant
C57BL/6J Mice	Le laboratoire Jackson	664	Les souris devraient avoir entre 5 et 8 semaines
Bouchon à vis microcentrifugeuse de 2 ml	Corning	430917