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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
- Obtention d’échantillons pour l’énumération de Clostridium difficile (C. difficile)
REMARQUE : Avant d’obtenir des matières fécales ou du cécal, pesez les tubes stériles de microcentrifuge sur une balance analytique. Notez le poids du tube sur le côté du tube, en arrondi à quatre décimales (par exemple, 0,9864 g). Appelez ce poids le « poids du tube ». Chaque échantillon prélevé doit être placé dans un tube de microcentrifuge stérile et pesé.
1. Collecte stérile des excréments de souris- Maintenez doucement chaque souris en saisissant l’animal par la peau lâche du cou et du dos afin d’immobiliser la tête. Utilisez l’auriculaire pour retenir doucement la queue de l’animal, exposant ainsi l’anus. Assurez-vous que l’animal ne vocalise pas et ne montre pas d’autres signes de détresse pendant la retenue.
- Tenez un tube de microcentrifuge stérile et pesé directement sous l’anus de l’animal. Il est impératif que le tube ne soit pas en contact direct avec la souris.
- Pendant que l’animal défèque, recueillez la granule fécale dans le tube. Gardez le tube à température ambiante jusqu’à ce que tous les échantillons fécaux soient collectés. Il peut falloir plusieurs minutes à une souris pour déféquer, ce qui nécessite des tentatives répétées de collecte des excréments.
- Pèser les tubes contenant des excréments sur la balance analytique. Notez le poids du tube, en arrondissant à quatre décimales (par exemple, 1,0021 g). Notons le poids obtenu comme le « poids final du tube ».
- Faites passer les échantillons fécaux dans la chambre anaérobie pour l’énumération bactérienne immédiatement après la collecte des selles.
- Énumération bactérienne de C. difficile
- Calculez le poids final du contenu (excréments) qui sera énuméré pour C. difficile. J’ai réalisé cela en soustrayant le « poids final du tube » du « poids du tube ».
- Calculez une dilution 1:10 du contenu en 1X solution saline tamponnée phosphate (PBS) et remettez en suspension en conséquence. Pour les granulés fécals, utilisez la pointe de la pipette pour déformer doucement la pellete en solution.
- Incubez anaérobiement ces échantillons resuspendus à température ambiante pendant 30 minutes, permettant au contenu de se déposer.
- Effectuer des dilutions en série pour chaque échantillon dans 1x PBS pour l’énumération des unités formant la colonie (UFC) par g de contenu (excréments). Faites cela de façon anaérobie.
- En utilisant une technique aseptique, transférez 100 μl de chaque dilution en série sur des plaques d’agar de céfoxitine céfoxitine (TCCFA) taurocholate. À l’aide d’un étaleur stérile en forme de L, étalez la dilution appliquée sur le média pour l’étaler uniformément sur la plaque. Une répartition uniforme de la dilution est essentielle pour une énumération précise des colonies.
- Incubez les plaques de façon anaérobie pendant 24 heures à 37 °C. À ce stade, énumérez les colonies de C. difficile pour obtenir l’UCF par g de contenu (féques). Les colonies de C. difficile sont plates et jaune pâle, présentent des bords irréguliers et une apparence de verre dépoli.
REMARQUE : Ce protocole peut être utilisé pour énumérer C. difficile à partir d’autres contenus gastro-intestinaux (GI) murins, y compris les teneurs iléales et côliques. Les plaques de réaction en chaîne par polymérase (PCR) peuvent être utilisées pour produire des dilutions en série.