Essai à base de fluorescence pour étudier les interactions des récepteurs des macrophages avec les antigènes bactériens

Résumé

Source : Barbero, A. M., et.al. Analyses de fluorescence pour l’étude de l’interaction de Mycobacterium tuberculosis avec le récepteur immunitaire SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)

Cette vidéo présente un test basé sur la fluorescence pour étudier l’interaction entre un récepteur macrophage et les antigènes Mycobacterium tuberculosis . Les antigènes marqués fluorescentement sur une couche de couverture sont incubés avec des extraits de protéiques de macrophages, réticulés, marqués par anticorps, et visualisés par des signaux de fluorescence qui se chevauchent.

Protocole

1. Interaction entre Mycobacterium tuberculosis et SLAMF1 par microscopie à fluorescence

1. Réticulation bactérie-protéine
   1. Introduisez des cache-toits ronds de 12 mm dans des plaques de culture à 24 puits (1 engourdi par puits) à l’aide d’une pince chirurgicale à nez rond.
      REMARQUE : Nettoyez soigneusement les bâtons de couverture avec de l’éthanol à 70 %. Si désiré, ils peuvent être autoclavés ou stérilisés sous lumière UV pendant 30 minutes.
   2. Incubez la couche de couverture avec 400 μL de 10 μg/mL de poly-D-Lysine toute la nuit à 4 °C. Couvrez la plaque de papier aluminium pour la protéger de la lumière.
   3. Le lendemain, retirez l’assiette du réfrigérateur et lavez la housse deux fois avec 1 mL d’eau.
   4. Laissez sécher la gaine.
   5. Diluer 20 μL (2 x 10⁶) de Mtb-R Ags dans 180 μL de 1x PBS. Les 200 μL finaux suffisent à couvrir complètement une couche de couverture.
   6. Incubez le couvre-cousse avec du Mtb-R Ags pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur cellulaire.
   7. Jetez le liquide restant et lavez deux fois avec 1 mL de 1x PBS (sérum tamponné phosphate).
      REMARQUE : À cette étape, l’adhésion correcte de Mtb-R au couvercle peut être vérifiée avec un microscope à fluorescence à l’aide des filtres correspondant au canal rouge.
   8. Ajoutez 400 μL de tampon bloquant (10 % de sérum bovin fœtal (FBS)) dans 1x solution sésale tamponnée phosphate (PBS) pendant 30 minutes à la RT en agitation (shaker).
   9. Laver deux fois avec 400 μL de tampon de blocage.
   10. Incuber avec 100 μL d’extrait protéique dilué dans 300 μL de 1x PBS pendant 2 heures à RT en agitation (shaker).
   11. Ajoutez 400 μL de formaldéhyde à 1 % dilué dans 1x PBS. Incuber pendant 15 minutes sous agitation (shaker) au RT.
   12. Ajoutez 500 μL de glycine 0,125 M diluée dans de l’eau. Incuber pendant 5 minutes sous agitation (shaker) au RT.
   13. Laver deux fois avec 1 mL de 1 PBS 1x.
   14. Ajoutez 400 μL de 2 mM d’éthylène glycol bis(succinimidylsuccinate) (EGS pendant 1 heure au RT lors de l’agitation (shaker).
   15. Répétez l’étape 1.1.13
       REMARQUE : La préparation des réactifs au moment de l’utilisation est fortement recommandée.
2. Coloration SLAMF1
   1. Enveloppez le couvercle de la plaque de culture dans un film de paraffine.
   2. Ajouter une goutte de 60 μL d’anticorps primaire anti-SLAMF1 précédemment titré (dilution 1:75) sur le couvercle recouvert de film de paraffine.
   3. Retirez soigneusement la housse de la plaque à l’aide de pinces chirurgicales courbes à pointe fine et d’aiguilles.
      REMARQUE : Pour faciliter le retrait du couverdissage, l’aiguille peut être pliée à un angle d’environ 45°.
   4. Inversez la housse de couverture sur la goutte contenant l’anticorps. Incuber pendant 30 minutes en RT dans le noir.
   5. Soulevez la gaine et lavez deux fois avec le tampon de blocage.
   6. Inversez la couche de couverture sur une nouvelle goutte contenant l’anticorps secondaire (dilution 1:200). Incuber pendant 30 minutes en RT dans le noir.
   7. Répétez l’étape 1.2.5.
   8. Retirez l’excès de liquide et montez la gaine de couverture sur une goutte de liquide de montage posée sur une lame en verre.
   9. Observez au microscope à fluorescence en utilisant des filtres adéquats.
      REMARQUE : Il est recommandé de travailler dans des conditions stériles. Diluez les anticorps dans le tampon bloquant. Manipulez la gaine avec soin pour éviter les rayures qui pourraient gêner l’observation au microscope. Un liquide de montage adapté à la fluorescence est fortement recommandé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps secondaire Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21121	Pour la microscopie à fluorescence
Anticorps primaire anti-SLAMF1	BioLegend	306302	Pour la microscopie à fluorescence
Aqua-Poly/Mount	Polysciences	18606-20	Supports de montage
Gaines de couverture 12mm	HDA	-	Pour l’analyse d’interaction par microscopie
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	Pour le traitement par réticulation
Formaldéhyde	Merck	K47740803613	Pour le traitement par réticulation
Lames en verre	Glass Klass	-	Pour l’analyse d’interaction par microscopie
Glycine	Sigma	G8898	Pour le traitement par réticulation
Imager.A2	Carl Zeiss	430005-9901-000	Microscope à fluorescence avec module d’illumination Colibri 7
Poly-D-lysine	Sigma Aldrich	A-003-M	Pour le traitement des couvertures
Rhodamine B	Sigma Aldrich	21955	Pour M. Coloration de la tuberculose