Développement d’un modèle d’infection larvaire par poisson-zèbre utilisant le microgavage

Résumé

Source : Li, J., et al. Développement d’un modèle larvaire d’infection par le poisson-zèbre pour Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo illustre la procédure de microgavage, où une larve de poisson-zèbre anesthésiée est immobilisée dans de l’agarose et injectée par voie orale avec une bactérie pathogène à l’aide d’une aiguille guidée par un traceur. L’accouchement non invasif imite l’infection naturelle, permettant d’analyser la réplication bactérienne, la libération de toxines et les dommages épithéliaux intestinaux.

Protocole

1. Gavage des larves de poisson-zèbre

1. Calibrez l’aiguille microgavage.
2. Mesurez le diamètre de la pointe de l’aiguille en la plaçant sur une lame d’étalonnage avec une goutte d’huile minérale. Assurez-vous que la pointe a un diamètre de 30 à 40 μm, émoussée et lisse. Jetez les aiguilles pointues ou rugueuses.
   REMARQUE : Les tranchants des aiguilles peuvent être émoussés par un enflammement rapide.
3. Préparez la solution de garde.
4. Chargez et montez l’aiguille sur un micromanipulateur.
5. Ajustez le micromanipulateur pour positionner l’aiguille à un angle de 45°.
6. Anesthésiez les larves de poisson-zèbre. Lorsque les larves cessent de bouger, transférez-les dans la rainure d’un moule à microgavage à l’aide d’une pipette Pasteur.
7. Placez une goutte d’agarose à faible fonte à 0,8 % sur les larves de poisson-zèbre pour la couvrir. Ajustez doucement les larves avec la tête dressée à un angle de 45° dans la rainure et les queues contre la paroi de la rainure. Assurez-vous que les angles des têtes sont à peu près identiques afin qu’ils soient alignés avec l’angle des aiguilles de garde. Placez la moisissure microgavage sur la glace pendant 30 à 60 s, permettant à l’agarose à faible fonte de se solidifier afin de stabiliser la position des larves.
8. Ajustez la pression d’injection entre 200 et 300 hPa. Réglez le temps d’injection à 0,1–0,3 s pour obtenir un volume d’injection de 3–5 nL de Clostridioides difficile.
9. Faites délicatement passer l’aiguille à travers l’agarose, puis dans la bouche des larves de poisson-zèbre, puis par l’œsophage. Une fois la pointe de l’aiguille à l’intérieur du bulbe antérieur de l’intestin, appuyez sur la pedale d’injection pour libérer les bactéries. Remplissez la lumière de l’intestin avec le volume délivré. Ne laissez pas le déborder de l’œsophage ou de la cloaque. Retirez doucement l’aiguille de la bouche du poisson-zèbre.
10. Après le gavage, sauvez les larves de poisson-zèbre infectées de l’agarose avec une pointe microchargeuse flexible en coupant d’abord l’agarose puis en soulevant les larves. Transférez ces larves dans un milieu de Danieau stérile à 30 %. Rincez les larves deux fois dans un substrat stérile. Transférez les larves dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm. Les larves seront maintenues jusqu’à 11 jours après la fécondation (dpf).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Agarose ultra-faible en gélification,
Faible fusion de l’agarose (LM)	Pronadisa	8050	Il est utilisé dans les plaques d’agarose
Verre capillaire	Appareil de Harvard	30-0019	Aiguilles d’injection
Clostridioides difficile			R20291, une souche ribotype 027, production TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	Plateforme open source		Traitement d’image
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Tire-aiguille horizontale	Sutter instrument Inc	P-87
L-cystéine	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Traitement d’image
Micro-injecteur	eppendorf	5253000017
Moules à microinjection	Outils de la Science Adaptative	TU1
Microscope confocal Leica SP8	Leica
Rouge phénol	Sigma-Aldrich	P0290
Chlorure de potassium (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Chlorure de sodium (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocholate	Carl Roth GmbH	8149
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Extrait de levure	BD Bacto	212750