Inoculation d’un agent pathogène bactérien dans les feuilles d’Arabidopsis par infiltration sous vide

Dans cet article

Résumé

Source : Rufián, J. S., et.al. Analyse unicellulaire de l’expression des gènes de Pseudomonas syringae dans les tissus végétaux. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre une méthode d’infiltration sous vide pour introduire un pathogène bactérien dans les feuilles d’Arabidopsis . L’approche utilise une suspension bactérienne préparée et des impulsions sous vide pour permettre une entrée uniforme à travers les stomates, entraînant une infection foliaire contrôlée.

Protocole

1. Inoculation des plantes d’Arabidopsis

REMARQUE : Dans cette étude, les souches Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 et P. syringae pv. Des phaseolicola 1448A ont été utilisées.

Préparez l’inoculum de P. syringae .
1. Rayez la souche d’intérêt de P. syringae d’un stock de glycérol à −80 °C sur une plaque LB (10 g/L de tryptone, 5 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 16 g/L d’agare bactériologique) complétée avec les antibiotiques appropriés. Incubez à 28 °C pendant 40 à 48 heures.
  REMARQUE : L’utilisation d’antibiotiques est recommandée si la souche d’intérêt porte un plasmide ou un gène de résistance génomique. Les concentrations d’antibiotiques recommandées pour P. syringae sont les suivantes : kanamycine (15 μg/mL), gentamycine (10 μg/mL), ampicilline (300 μg/mL).
2. Gratter la biomasse bactérienne et la résuspendre dans 5 mL de 10 mM de MgCl₂. Mesurez le OD₆₀₀ et ajustez à 0,1 en ajoutant 10 mM de_{MgCl 2}.
  REMARQUE : Un OD_{de 600} de 0,1 d’une culture de P. syringae correspond à 5 x 10⁷CFU·mL⁻¹.
3. Effectuer des dilutions en série dans 10 mM de_MgCl2 pour atteindre une concentration finale d’inoculation de 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹. Préparez 200 mL d’inoculum pour les plantes d’Arabidopsis .
4. Juste avant l’inoculation, ajoutez le tensioactif Silwett L-77 à une concentration finale de 0,01 % pour Arabidopsis. Notez que Silwett est quelque peu préjudiciable au tissu d’Arabidopsis .
Effectuez une infiltration sous vide.
1. Pour l’infiltration d’Arabidopsis, placez deux bâtons de bois formant un X au-dessus du pot (Figure 1E), puis placez le pot face vers le bas au-dessus d’une boîte de Petri de 14 cm de diamètre contenant l’inoculum de 200 mL (Figure 1F).
2. Insérez les plantes immergées dans la solution d’inoculum dans une chambre à vide (Figure 1G) et donnez une impulsion de 500 mbar pendant 30 secondes pour infiltrer les feuilles. Répétez l’impulsion sous vide 2 à 3 fois jusqu’à ce que la feuille soit complètement infiltrée (Figure 1H).
3. Égouttez l’excès de solution d’inoculum avec une feuille de papier et ramenez les plantes dans leur chambre de croissance correspondante.

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Résultats

Figure 1 : Inoculation bactérienne et extraction d’apoplastes à l’aide de plantes Arabidopsis . (A) Préparation du pot avec la grille métallique correctement fixée. (B) Semer les graines à l’aide d’...