Imagerie à haut débit de l’infection intracellulaire par Brucella abortus dans les cellules épithéliales de l’hôte

Résumé

Source : Casanova, A., et al. Essais basés sur la microscopie pour le criblage à haut débit des facteurs de l’hôte impliqués dans l’infection par Brucella des cellules hela. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre l’imagerie à haut débit de l’infection par Brucella abortus dans les cellules épithéliales avec un knockdown STING médié par le SIRNA afin d’étudier le rôle de la détection de l’ADN cytosolique dans la réplication bactérienne intracellulaire et la réponse immunitaire innée de l’hôte.

Protocole

1. Infection et fixation

1. Un jour avant l’infection, inoculez la quantité déterminée de culture de démarrage de B. abortus dans un milieu de 50 ml TSB/Km (bouillon de soja tryptique contenant 50 μg/ml de kanamycine) dans une bouteille à bouchon vissé de 250 ml. Scellez la bouteille avec du Parafilm et faites pousser les bactéries toute la nuit à 37 °C et 100 tr/min sur un shaker orbital jusqu’à_{un OD 600} = 0,8-1,1.
2. Mesurez_{le OD 600} de la culture bactérienne et préparez le milieu d’infection en diluant la culture bactérienne dans du DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) / 10 % de FCS (sérum pour veaux fœtal) afin d’obtenir la multiplicité d’infection (MOI) souhaitée.
   REMARQUE : Pour obtenir un taux d’infection de 5 à 10 % dans les cellules HeLa, un MOI de 10 000 est utilisé. Une courbe de titration MOI doit être réalisée pour chaque type cellulaire afin d’obtenir des taux d’infection optimaux.
3. Échangez le milieu de transfection de la plaque à 384 puits par 50 μl du milieu d’infection à l’aide d’un lave-plaques automatisé.
4. Centrifugez la plaque de 384 puits à 400 x g et 4 °C pendant 20 minutes.
   REMARQUE : Cela aide à synchroniser le processus d’infection.
5. Scellez la plaque avec du Parafilm et faites-la éclore sur une plaque en aluminium préchauffée dans un incubateur humide à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 4 heures.
6. Lavez les cellules avec du DMEM/10 % de FCS contenant 100 μg/ml de Gm (gentamicine) pour inactiver les bactéries extracellulaires à l’aide d’un lave-plaques automatisé (utilisez 200 μl/lavage de trop-plein de puits).
   REMARQUE : Lors d’un lavage par débordement, la machine à laver automatique délivre et aspire simultanément le substrat.
7. Pour l’essai d’entrée, lavez les cellules une seconde fois avec du DMEM/10 % de FCS contenant 100 μg/ml Gm et 100 ng/ml d’aTc en utilisant le laveur automatique de plaques (utilisez 200 μl/lavage de trop-plein de puits).
8. Scellez la plaque avec du parafilm et revenez sur une plaque d’aluminium préchauffée dans l’incubateur humide à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 40 heures ou 4 heures supplémentaires, respectivement pour le test final et l’essai d’entrée.
9. Pour la fixation, lavez les puits avec du PBS (solution physiologique tamponnée phosphate) à l’aide d’un laveur automatique de plaques (utilisez un lavage de 200 μl/débordement de puits).
10. Échanger le PBS avec 50 μl de paraformel à 3,7 % (PFA) dans des HEPES de 0,2 M à pH 7,4 en utilisant la laveuse automatique de plaques.
    REMARQUE : Attention : le PFA est toxique par inhalation, en contact avec la peau et si elle est avalée.
11. Incubez pendant 20 minutes à température ambiante.
12. Échangez le milieu de fixation par un PBS de 50 μl à l’aide de la laveuse automatique de plaques.
    REMARQUE : Les échantillons sont désormais prêts à être prélevés du BSL3 si nécessaire.
    ATTENTION : Le prélèvement de tout échantillon d’une installation BSL3 (niveau de biosécurité 3) est soumis à une évaluation des risques et à la validation de la procédure et dépend des réglementations applicables en matière de biosécurité.

2. Coloration

1. Lavez les cellules deux fois avec 50 μl PBS.
2. Perméabiliser les cellules dans 50 μl 0,1 % de Triton-X-100 dans PBS pendant 10 minutes.
3. Laver les cellules trois fois avec du PBS. Ajoutez 20 μl de PBS contenant 1 μg/ml de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) et incubez pendant 30 minutes à température ambiante.
4. Lavez les cellules trois fois dans le PBS et protégez la tache de la lumière avec du papier aluminium.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bouillon de soja tryptique (TSB)	Fluka	22092
Sulfate de kanamycine	Sigma-Aldrich	60615
Bouteille à capsule vissée de 250 ml	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Sérum fœtal pour le veau (FCS)	Gibco	10270	Inactivation thermique
Plaque Greiner CELLSTAR 384 puits	Sigma-Aldrich	M2062
Papier aluminium peelable	Partenaire	6570
Distributeur de réactifs : « Distributeur de réactifs Multidrop 384 »	Thermo Scientific	5840150	Un distributeur de réactifs alternatifs peut être utilisé.
Réactif de transfection : « Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Lave-plaques automatisée : « Laveuse de plaques ELx50-16 »	BioTek	ELX5016	Cette laveuse de plaques contient un collecteur à 16 canaux adapté aux plaques à 384 puits. Il s’insère dans un meuble de biosécurité et possède un couvercle qui couvre la plaque pendant le lavage, ce qui réduit le risque de production d’aérosols. Des rondelles de plaques alternatives avec des caractéristiques similaires pourraient être utilisées.
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
PBS	Gibco	20012
Paraformélélidoïde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolvez dans un tampon HEPES 0,2 M, pH 7,4. Conservez à -20 °C et décongelez fraîchement la veille de l’utilisation. Attention, le PFA est toxique par inhalation, en contact avec la peau et si elle est avalée.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
SiRNA de Kif11	Dharmacon	L-003317-00
ARN<[><[>ARN<]> ARPC3	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Dispositifs moléculaires	IXM IMAGING MSCOPE	Microscope d’imagerie cellulaire automatisé équipé d’un étage en Z motorisé de précision. Des systèmes alternatifs pour la microscopie automatisée et des composants alternatifs pour les logiciels durs et logiciels spécifiés ci-dessous peuvent être utilisés.