Détection de la susceptibilité aux antibiotiques bactériens à l’aide d’un microscope à diffusion Raman stimulée

Résumé

Source : Zhang, M. et al., Tests rapides de susceptibilité antimicrobienne par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre l’application de la microscopie à diffusion Raman stimulée pour évaluer la susceptibilité aux antibiotiques en suivant l’activité métabolique marquée au deutérium. En surveillant les signaux carbone-deutérium, la méthode permet la détection rapide de populations bactériennes résistantes et sensibles.

Protocole

1. D₂Traitement d’incorporation O en présence d’antibiotiques (Figure 1a)

1. Vérifiez la concentration bactérienne en mesurant la densité optique (OD) avec un photomètre à une longueur d’onde de 600 nm.
2. Diluez la solution bactérienne à l’aide du milieu normal pour le bouillon Mueller-Hinton (MHB), qui ne contient pas de deutérium, pour atteindre une concentration cellulaire finale de 8 x 10⁵ UFC/mL. Vortex doucement pour mélanger les cellules bactériennes.
3. Préparez 300 μL d’aliquotes de la solution bactérienne dans sept microtubes de 1,5 mL, et 600 μL d’aliquotes de la solution bactérienne dans un microtube de 1,5 mL.
4. Ajoutez 4,8 μL de solution d’antibiotique (gentamicine ou amoxicilline) (1 mg/mL) dans le microtube contenant 600 μL de la solution bactérienne, pour atteindre la concentration finale d’antibiotique à 8 μg/mL.
5. Prélever 300 μL de solution sur les 8 μg/mL de solution bactérienne contenant des antibiotiques, puis ajouter 300 μL supplémentaires de solution bactérienne, afin de produire une solution bactérienne contenant des antibiotiques diluée deux fois (4 μg/mL).
6. Répétez la dilution en série double des antibiotiques tests, la gentamicine ou l’amoxicilline, jusqu’à atteindre le microtube avec la concentration la plus basse (0,25 μg/mL), puis écartez 300 μL du tube. Pour la gentamicine et l’amoxicilline, les concentrations sérieuses varient de 0,25 μg/mL à 8 μg/mL.
   1. Laissez un tube sans antibiotiques pour le contrôle du blanc. Ce sera le contrôle positif pour inspecter l’activité métabolique bactérienne sans traitement antibiotique mais avec un traitement_D2O.
   2. Laissez une sonde sans antibiotiques et sans D_2Opour le contrôle négatif.
7. Incubez l’aliquote bactérienne avec un certain antibiotique (gentamicine ou amoxicilline) contenant un milieu MHB pendant 1 heure.
8. Lors de l’incubation, préparez une dilution en série d’antibiotiques contenant un milieu contenant 100 % de_D2O, avec le même gradient de concentration d’antibiotiques préparé à l’étape 1.6. Pour la gentamicine et l’amoxicilline, les concentrations sérieuses varient de 0,25 μg/mL à 8 μg/mL.
9. Après 1 heure de traitement antibiotique, ajoutez respectivement 700 μL d’antibiotique dilué en série et un milieu MHB contenant 100 %_D2O aux 300 μL de bactéries prétraitées par antibiotiques dans la même concentration (préparée à l’étape 1.6).
   1. Par exemple, ajoutez 700 μL de milieu MHB contenant 100 % de D₂O (contenant 8 μg/mL d’antibiotique) aux 300 μL de bactéries prétraitées à 8 μg/mL. De la même manière, transférez vers les tubes correspondants de la concentration suivante, et homogénéisez en pipettant plusieurs fois vers le haut et vers le bas.
   2. Ajoutez 700 μL de médium MHB 100 % D 2 Osans antibiotiques à 300 μL de bactéries sans antibiotiques (préparées à l’étape 1.6.1) en témoin vierge.
   3. Incubez à 37 °C dans un shaker d’incubation à 200 tr/min pendant 30 minutes supplémentaires.
      REMARQUE : À cette étape, la concentration finale de D₂O dans le milieu pour le test est de 70 %.
10. D’abord, centrifugez 1 mL d’antibiotique et l’échantillon bactérien traité à_D2O à 6200 x g pendant 5 minutes à 4 °C, puis lavez deux fois avec de l’eau purifiée. Enfin, fixez les échantillons dans une solution de formol à 10 % et conservez-les à 4 °C.

2. Imagerie stimulée de diffusion Raman (SRS) de l’incorporation métabolique de D_2Odans une seule bactérie

1. Lavez 1 mL de solution bactérienne fixée avec de l’eau purifiée, puis centrifugez à 6200 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Retirez le surnageant. Enrichir la solution bactérienne à environ 20 μL.
2. Déposez la solution bactérienne sur un verre-revêtement recouvert de poly-L-lysine. Sandwichez et scellez l’échantillon pour l’imagerie SRS.
3. Imagez les bactéries à la fréquence vibratoire C-D de 2168 cm-1 à l’aide d’un microscope SRS.
   1. Entrer et régler la longueur d’onde de la pompe à 852 nm à l’aide du logiciel de contrôle d’un ordinateur.
   2. Mesurez la puissance du laser à l’aide d’un wattmètre. Réglez la puissance du laser à pompe à l’échantillon à ~8 mW et celle du laser Stokes à ~40 mW en ajustant la plaque d’ondes intermédiaires devant la sortie laser.
      REMARQUE : Dans le microscope SRS, un laser femtoseconde accordable avec un taux de répétition de 80 MHz fournit les lasers à pompe (680 à 1300 nm) et Stokes (1045 nm).
4. En ajustant les vis des miroirs de réflexion, on aligne spatialement les faisceaux pompe et Stokes et on dirige les deux faisceaux vers un microscope vertical équipé d’un système de miroir galvo 2D pour le balayage laser.
   1. Utilisez un objectif d’immersion 60x pour focaliser la pompe et les lasers Stokes sur l’échantillon.
   2. Utilisez un condenseur d’huile pour collecter les signaux de l’échantillon dans la direction directe.
   3. Utilisez un filtre passe-bande pour filtrer le laser Stokes avant de le diriger vers une photodiode.
   4. Extraire le signal Raman stimulé par un amplificateur verrouillé et détecter les signaux par une photodiode.
5. Réglez chaque image SRS pour qu’elle contienne 200 x 200 pixels et le temps de séjour des pixels à 30 μs dans le panneau de configuration du logiciel. Le temps total d’acquisition pour une image est de ~1,2 s. Réglez la taille du Step à 150 nm, donc la taille de l’image est d’environ 30 x 30^{μm 2}. Imagez au moins trois champs de vision pour chaque échantillon.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Modulation acusto-optique	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	Modulation du faisceau laser Stokes
Amoxicilline	Sigma Aldrich	A8523-5G
Filtre passe-bande	Chroma	HQ825/150m	Bloquez le faisceau laser Stokes avant la photodiode
Chlorure de calcium	Sigma Aldrich	C1016-100G	Réglage des cations
Bouillon Mueller-Hinton ajusté par les cations	Fisher Scientific	B12322	Test de sensibilité antimicrobienne des micro-organismes par des méthodes de dilution du bouillon
Centrifugeuse	Thermo Scientific	75002542
Lunettes de couverture	VWR	16004-318
Tube de culture avec capuchon à boutons	Marque Fisher	149569B
Oxyde de deutérium		151882	Solvant organique pour dissoudre les antibiotiques
Oxyde de deutérium-D6	Sigma Aldrich	156914	Solvant organique comme norme pour calibrer le système d’imagerie SRS
Escherichia coli BW 25113	Le Centre de Patrimoine Génétique de Coli	7636
Tubes microcentrifugeuses en polypropylène Eppendorf 1,5 mL	Marque Fisher	05-408-129
Sulfate de gentamicine	Sigma Aldrich	G4918
Filtres hydrophiles au polyvinylidène fluorure	Millipore-Sigma	SLSV025NB	Taille des pores : 5 μm
Laser pulsé femtoseconde InSight DeepSee	Spectra-Physique	Modèle : insight X3	Source laser accordable et source laser fixe à 1045 nm pour l’imagerie SRS
Amplificateur verrouillé	Zurich Instrument	HF2LI	Démoduler les signaux SRS
Condenseur d’huile	Olympe	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	Collection de la culture de type américain	ATCC 47085
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01	Détecteur
Tube conique en polypropylène 15 mL	Faucon	14-959-53A
Filtres à polypropylène	Thermo Scientific	726-2520	Taille des pores 0,2 μm
Plaques de Petri stériles	Corning	07-202-031
Seringue 10 mL	Marque Fisher	14955459
Spectrophotomètre UV/Vis	Beckman Coulter	Modèle : DU 530	Mesure de la densité optique à une longueur d’onde de 600 nm
Mélangeur vortex	VWR	97043-562
Objectif de l’eau	Olympe	UPLANAPO/IR	60×, NA 1,2