Imagerie confocale haute résolution des hémocytes infectés par un agent pathogène de Drosophila

Résumé

Source : Hiroyasu, A., et al. Extraction d’hémocytes de larves de Drosophila melanogaster pour infection microbienne et analyse. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’imagerie confocale haute résolution des hémocytes de Drosophila melanogaster infectés par Coxiella burnetii afin de visualiser la localisation des agents pathogènes en 3D, permettant une analyse détaillée de la dynamique intracellulaire des infections et des interactions hôte-pathogène.

Protocole

1. Imagerie confocale
   1. Configurez le microscope confocal pour l’imagerie tricolore de DAPI (4',6-Diamidino-2-phénylindole), EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) et mCherry. Utilisez le réglage suivant : excitation DAPI (ex) 405 nm, émission (em) 415-480 nm ; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm ; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
   2. Placez l’échantillon sur le microscope et concentrez l’échantillon à l’aide d’un objectif à ouverture numérique (NA) 63X/1,4. Localiser les hémocytes désirés dans le champ de vision pour l’imagerie.
   3. Ajustez la puissance du laser et les gains du détecteur pour obtenir une exposition appropriée de l’échantillon. Vérifiez plusieurs plans Z pour vous assurer que le niveau d’exposition est approprié pour toute l’épaisseur de l’échantillon.
   4. Trouvez les positions supérieure et inférieure sur l’axe z d’un hémocyte entier. Fixez ces positions comme positions de départ et de fin pour la section en Z.
   5. N’utilisez que le zoom de balayage pour imager la zone contenant l’hémocyte. Des facteurs de zoom de 3X sont souvent utilisés.
   6. Collectez la série d’images à une résolution appropriée, par exemple 1024 x 1024 pixels dans le plan x-y, et un espacement de 0,3 μm dans la dimension z.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Coxiella burnetii - mCherry	Dr Heinzen, R.
Verre de couverture pour microscope	Fisher Scientific	12-545-80
4',6-diamidino-2-phénylindole	Thermo Fisher Scientific	62247
Microsope confocal	Leica	Microscope laser à balayage confocal à lumière blanche TCS SP8-X
Lames de microscope	Fisher Scientific	12-552-3