Analyse unicellulaire de l’expression génique à partir de pathogènes extraits par des plantes

Résumé

Source : Rufián, J. S., et al. Analyse unicellulaire de l’expression des gènes de Pseudomonas syringae dans les tissus végétaux. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo démontre une méthode d’analyse de l’expression génique dans des bactéries pathogènes extraites de plantes au niveau unicellulaire en utilisant un facteur de transcription marqué fluorescentement. L’imagerie confocale révèle une hétérogénéité dans l’expression des gènes de virulence, mettant en lumière la diversité fonctionnelle au sein d’une population bactérienne clonale.

Protocole

1. Analyse unicellulaire des bactéries extraites de l’apoplaste

1. Préparez une solution d’agarose à 1,5 % dans de l’eau distillée. Une fois fondues, ajoutez suffisamment de volume pour remplir l’espace entre deux lames de microscopie posées côte à côte et placez une autre lames dessus (Figure 1). Laissez-les sécher 15 minutes puis retirez soigneusement la lame posée sur le dessus. Avec une lame, coupez le tampon d’agarose en morceaux de 5 mm x 5 mm juste avant l’utilisation.
2. Parallèlement, centrifugez 1 mL de la bactérie extraite de l’apoplaste à 12 000 x g pendant 1 minute à température ambiante, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette, puis remettez le pellet dans 20 μL d’eau pour concentrer les cellules. Placez une goutte de 2 μL des cellules concentrées sur une couche de 0,17 mm et couvrez la goutte avec un morceau de 5 mm x 5 mm du coussinet d’agarose obtenu précédemment à l’étape 1, comme représenté à la Figure 1.
3. Visualisez la préparation bactérienne au microscope confocal (voir Tableau des matériaux). Pour identifier les bactéries fluorescentes vertes, on utilise le laser d’excitation à 488 nm et un filtre d’émission allant de 500 nm à 550 nm. Pour identifier toutes les bactéries, utilisez le champ clair et fusionnez les deux champs.
4. Traiter les images confocales à l’aide de Fiji (voir Tableau des matériaux). Pour cela, utilisez le plugin MicrobeJ pour identifier le contour de la cellule bactérienne et mesurer l’intensité de fluorescence à l’intérieur.
   REMARQUE : L’acquisition d’images à partir de bactéries isolées (non regroupées) est recommandée pour cette analyse.

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique de la monture et de la préparation de la tampon d’agar.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Couche de couverture de 0,17 mm			Aucune exigence particulière
Maille métallique 1,6 x 1,6 mm	Buzifu		Grillage en fibre de verre
Tubes coniques de 50 mL	Sarstedt
Agarose	Merk
Confocal Microscope Stellaris	Leica Microsystems
Logiciels fidjiens