Modèle intestinal in vitro pour évaluer l’adhésion et l’internalisation bactériennes

Résumé

Source : Calatayud Arroyo, M., et al. Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique à l’interface intestin-microbe in vitro. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente un modèle intestin-microbe in vitro pour étudier la viabilité bactérienne. Une co-culture de cellules Caco-2 et HT29-MTX est incubée avec des bactéries pré-traitées dans des conditions digestives simulées. L’intégrité de la barrière épithéliale est évaluée à l’aide de résistance électrique transépithéliale, et des fractions du milieu, du mucus solubilisé, du lysat cellulaire et des débris cellulaires sont collectées pour une analyse en aval.

Protocole

1. Souches et conditions de culture

REMARQUE : La communauté orale synthétique était composée de souches couramment présentes dans le microbiome oral.

1. Obtenez les souches suivantes à partir de l’American Type Culture Collection (ATCC) : Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) et Streptococcus mitis (ATCC 49456).
2. Acquérir Veillonella parvula auprès de la collection allemande de micro-micro-cultures et de cultures cellulaires de l’Institut Leibniz DSMZ (DSM 2007), Streptococcus sanguinis de la collection de bactéries BCCM/LMG (LMG 14657), et utiliser Streptococcus salivarius souche TOVE-R, ainsi que Streptococcus oralis.

2. Développement d’une communauté multi-espèces représentative du microbiome buccal

REMARQUE : Générer une communauté synthétique pour simuler la capacité potentielle d’adhérence des bactéries orales à l’épithélium intestinal in vitro . Faites pousser des bactéries sur des plaques d’agar sanguine complétées avec 5 μg/mL d’hémin, 1 μg/mL de ménadione et 5 % de sang de cheval défibriné stérile. En résumé :

1. Dissouds 100 mg d’hémine dans 2 mL d’hydroxyde de sodium (NaOH) de 1 M, et ajoute 100 mL d’eau distillée autoclavée. Conserver dans un contenant sombre. Stérilisez à travers un filtre de 0,22 μm avant d’ajouter au milieu.
2. Dissoudre 100 mg de ménadione dans 20 mL d’éthanol à 96 %. Stérilisez à travers un filtre de 0,22 μm avant d’ajouter au milieu.
3. Préparez 1 L de milieu d’agar sanguin (voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant et l’autoclave. Laissez refroidir avant d’ajouter le sang de cheval et les compléments. Mélangez et versez les assiettes.
4. Préparez un bouillon modifié pour perfusion cerve-cœur (BHI). Ajoutez 5 μg/mL d’hémine et 1 μg/mL de ménadione après l’autoclavage.
5. Distribuez 9 mL du milieu dans des tubes Hungate, et fermez avec un bouchon en caoutchouc et un bouchon en aluminium. Rinçez les tubes avec de l’azote/dioxyde de carbone ou du N₂/CO₂ (90 %/10 %).
6. Récupérez 1 mL de milieu anaérobie avec une seringue et placez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Choisissez des colonies individuelles de chaque espèce bactérienne, resuspendez dans le milieu, puis transférez à nouveau dans le BHI anaérobie modifié. Écouver pendant 48 heures à 37 °C, sauf pour S. salivarius, qui doit être incubé pendant 24 heures.
7. Si nécessaire, confirmez la pureté des cultures avant de constituer la communauté synthétique. En résumé :
   1. Extraire l’ADN des cultures liquides et amplifier le gène 16S rRNA à l’aide des amorces 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) et 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT), et le programme suivant : 5 minutes à 95 °C, 30 cycles à 95 °C pendant 1 minute, 55 °C pendant 1 minute, et 72 °C pendant 1,5 minute, suivis d’une dernière étape d’extension de 5 minutes à 72 °C.
   2. Purifiez le produit de la réaction en chaîne polymérase (PCR) avec un kit commercial (voir Tableau des matériaux), en suivant les instructions du fabricant.
   3. Effectuer la réaction de séquençage des produits purifiés dans un volume total de 10 μL contenant 0,5 μL de colorant (voir Tableau des matériaux), 3,2 pmol d’amorce M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAGTCACGAC), 2,0 μL de tampon de séquençage 5x et 20 ng de gabarit, en utilisant un système de séquençage commercial avec kit (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Nous avons fait réaliser cette procédure commercialement.
   4. Effectuez une recherche BLAST sur toutes les séquences (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) pour déterminer le taxon connu le plus proche et comparez avec la séquence de la souche originale à l’aide de l’outil en ligne RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) et du service d’alignement SINA (https://www.arb-silva.de/aligner/).
8. Mesurez le nombre de cellules à la fin de l’incubation, en utilisant la cytométrie en flux et la coloration SYBR Green/Propidium Iodure. Diluez les cultures à 10^{cellules de 5 mL-1}, en utilisant un BHI modifié.
9. Ajoutez 1 mL de S. mitis à 75 mL de BHI anaérobie et incubez jusqu’à la phase stationnaire (6 h). Ensuite, prélever 0,75 mL de chaque souche diluée et mélanger dans des conditions anaérobies.
10. Une fois toutes les cultures mélangées, prenez 1 mL du microcosme et ajoutez-les aux 75 mL de BHI. Incuber la communauté synthétique sous 10 % de CO₂, 10 % d’hydrogène (H₂), 80 % d’N, pendant 48 heures à 37 °C et 200 tr/min (voir Tableau des matériaux).
11. Mesurez la densité cellulaire comme dans 2,8. avant de présenter la communauté au modèle cellulaire. La composition de la communauté peut être évaluée par PCR quantitatif en temps réel. De plus, utilisez le séquençage des amplicons du gène 16S rRNA pour fournir des informations sur les membres initiaux présents. Pour l’un ou l’autre protocole de confirmation d’identité, utilisez l’ADNc comme modèle pour indiquer que les bactéries transcrivent activement des protéines, et utilisez l’ADN comme modèle pour révéler la présence ou l’absence des souches.

3. Pratiques générales de culture cellulaire

REMARQUE : Obtenez des lignées cellulaires utilisées auprès de la Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées (Caco-2 ECACC 86010202 et HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, Public Health England, Royaume-Uni). Des réactifs pour la culture cellulaire peuvent être achetés (voir Tableau des matériaux), sauf indication contraire.

1. Entretien et passage des lignées cellulaires Caco-2 et HT29-MTX NOTE : Les cellules Caco-2 et HT29-MTX sont régulièrement cultivées dans des flasques de culture^{tissulaire de 25 cm} 2 contenant un milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété (Tableau 1). Les cellules sont trypsinisées lorsque la confluence de 60 à 70 % est atteinte.
   1. Retirez le milieu de culture cellulaire des flasques. Laver deux fois avec 5 mL de PBS sans calcium/magnésium (Ca⁺⁺/Mg⁺⁺).
   2. Ajoutez 2 mL d’une solution de trypsine à 0,5 mg/L et 0,22 g/L d’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA). Distribuez la solution de trypsine en déplaçant doucement la fiole. Retirez 1,5 mL de la solution de trypsine et faites couver le flascon à 37 °C pendant 10 minutes.
   3. Vérifiez au microscope si des cellules sont détachées de la surface de la fiole. Faites couver pendant 5 minutes supplémentaires, si besoin.
   4. Ajoutez 5 mL de milieu de culture cellulaire complétée au flascon pour inactiver la trypsine. Pipette de haut en bas pour obtenir une suspension homogène monocellulaire.
   5. Immédiatement, prenez une aliquote de 50 μL de la suspension cellulaire et mélangez-la avec une solution stérile de bleu de Trypan à 0,4 % dans une proportion 1:1 (v/v) pour les cellules Caco-2 ou 1:5 v/v pour HT29-MTX. Mélanger par pipette et charger dans une chambre de comptage (voir Tableau des matériaux).
   6. Comptez les cellules viables (globules blancs brillants) au microscope (voir les instructions du fabricant).
   7. Semez dans une nouvelle fiole à une densité de 4 x 10⁵ cellules/^{cm 2} et 1 x 10⁴ cellules/^{cm 2}, respectivement pour Caco-2 et HT29-MTX.
      REMARQUE : (1) Les cellules Caco-2 se différencient et forment des jonctions serrées une fois la confluence atteinte. Il est extrêmement important d’éviter la surconfluence avant la trypsinisation. La prolifération cellulaire dans la fiole peut entraîner une défaillance du décollement cellulaire après trypsinisation et/ou agglomération cellulaire. (2) Les cellules HT29-MTX sont des cellules productrices de mucus avec une forte activité métabolique. Ces caractéristiques peuvent provoquer une acidification rapide du milieu de culture cellulaire, surtout si les cellules sont à haute densité. Le tampon 4-(2-hydroxyéthyle)-1-piperazine, acide éthansulfonique (HEPES) peut être ajouté au milieu de culture cellulaire (Tableau 1) pour maintenir le pH entre 7 et 7,2. Si le pH baisse, le milieu peut être échangé lorsque la confluence est inférieure à 50 %. Cependant, si la confluence > 50 %, la culture cellulaire doit être divisée.

4. Assemblage d’un modèle de cellules multicompartiments simulant l’interface intestin-hôte-microbe

REMARQUE : Compléter la co-culture dans des puits à double chambre (diamètre 24 mm, taille des pores 0,4 μm ; voir Tableau des matériaux).

1. Ajoutez 1,5 mL de milieu de culture cellulaire complet au compartiment apical et 2 mL au compartiment basal. Pré-incubez pendant 20 à 30 minutes pour obtenir une répartition uniforme de la suspension cellulaire lors de la sémination.
2. Trypsinisez la culture cellulaire de Caco-2 et HT29-MTX comme décrit à la section 3. La procédure de trypsinisation doit être suivie avec précision pour obtenir une distribution homogène des deux lignées cellulaires, dans une seule suspension cellulaire, sans ammacs.
3. Comptez les cellules viables comme décrit dans la version 3.1.8.
4. Ajustez la densité cellulaire à 6,5 x 10⁴ cellules/^cm2 dans une proportion de 90/10 de cellules Caco-2/HT29-MTX.
5. Homogénéisez les suspensions cellulaires et ajoutez le volume correspondant de cellules Caco-2 et HT29-MTX dans un récipient stérile prérempli avec des milieux de culture cellulaire complétés. Retirez le milieu pré-incubé du côté apical de la chambre par aspiration.
6. Mélangez doucement la suspension cellulaire en pipettant, puis transférez 1,5 mL dans le compartiment apical des inserts de la chambre. La procédure d’ensemencement nécessite une homogénéisation constante de la suspension cellulaire, car les cellules ont tendance à sédimenter. Selon l’expérience de l’utilisateur et la vitesse de travail, la suspension des cellules doit être mélangée après la distribution de 1 à 3 puits.
7. Déplacez doucement les plaques d’avant en arrière, puis de droite à gauche à droite (5 à 10 fois) pour obtenir une répartition uniforme des cellules dans le puits. Transférez dans l’incubateur et répétez le mouvement des plaques.
8. Maintenir la co-culture des cellules Caco-2/HT29-MTX pendant 15 jours, en rafraîchissant les compartiments apicaux et basaux tous les 2 jours avec un DMEM renforcé. Après cette période, le milieu de culture cellulaire peut être remplacé par du DMEM complété sans solution antibiotique ou antimycotique.
9. Maintenez le système jusqu’à 20 à 21 jours après l’ensemencement en rafraîchissant le substrat tous les 2 jours.
10. Mesurez l’intégrité de la barrière épithéliale avant de commencer le test, en utilisant un système de résistance électrique (voir Tableau des matériaux), en suivant les instructions du fabricant.
    1. Assurez-vous que l’équipement de résistance électrique transépithéliale (TEER) est entièrement chargé (>24 h) avant de commencer les mesures.
    2. Débranchez l’équipement TEER de l’alimentation et couvrez-le avec un sac plastique autoclave. Fais un trou dans le sac pour introduire l’électrode et le branche dans la prise d’entrée du posemètre. Vaporisez à 70 % d’éthanol/eau (v/v) avant d’introduire l’équipement TEER dans l’armoire de débit.
    3. Pour désinfecter l’électrode, immergez les extrémités de l’électrode dans une solution à 70 % d’éthanol/eau (v/v) pendant 15 minutes. Laissez sécher à l’air libre pendant 15 secondes. Rincez l’électrode dans un milieu de culture cellulaire préchauffé.
    4. Sortez les cellules de l’incubateur et laissez-les atteindre la température ambiante à l’intérieur de l’armoire de circulation.
    5. Assurez-vous que le compteur est déconnecté du chargeur. Réglez l’interrupteur de mode sur Ohms et allumez l’interrupteur d’alimentation.
    6. Mesurez la résistance de la cellule en immergeant l’électrode avec la pointe la plus courte dans l’insert et la pointe la plus longue hors du puits. Gardez l’électrode à un angle de 90° par rapport à l’insert de la plaque.

5. Survie bactérienne après des conditions de transit gastro-intestinal in vitro

REMARQUE : Préparez toutes les dilutions avec de l’eau ultrapure. Filtrez toutes les solutions à travers un filtre de 0,22 μm et effectuez la procédure de digestion dans des conditions stériles.

1. Digestion orale :
   1. Placer 3 mL de la communauté bactérienne dans un tube stérile de 50 mL, mélanger avec 3 mL de liquide salive simulé (SSF), contenant (dans le mmol ^L-1) : du chlorure de potassium (KCl), 15,1 ; phosphate de potassium dihydrogène (_{KH 2}PO₄), 3,7 ; bicarbonate de sodium (_{NaHCO 3}), 6,8 ; chlorure de magnésium hexahydraté [MgCl₂(H₂O)₆], 0,5, carbonate d’ammonium [(NH₄) CO₃], 0,06 ; acide chlorhydrique (HCl), 1.1 ; chlorure de calcium dihydraté [CaCl₂(H₂O)₂], 0,75. Ajoutez 75 U/mL de α-amylase provenant de la salive humaine de type IX-A et 2 g/L de mucine de l’estomac porcin de type II dans la SSF.
   2. Incubez le mélange pendant 2 minutes à 37 °C et 100 tr/min. Prélever un échantillon de 2 mL pour l’extraction d’ADN et la quantification par cytométrie en flux (S1).
2. Digestion gastrique :
   1. Ajouter 4 mL de liquide gastrique simulé (SGF), contenant (en mmol L-1) : KCl, 6,9 ; _{KH 2}PO₄, 0,9 ; _{NaHCO 3}, 25 ; chlorure de sodium (NaCl), 47,2 ; MgCl₂(_{H 2}O)₆, 0,1 ; (NH₄)CO₃, 0,5 ; HCl, 15,6 ; CaCl₂(H₂O)₂, 0,075. De plus, le SGF contenait 2 g/L de mucine provenant de l’estomac porcin de type II de porc.
   2. Mesurez le pH et ajustez à un pH 3 avec 1 M HCl, si besoin. Incuber à 37 °C et 100 tr/min. Prélève un échantillon de 2 mL (S2).
3. Digestion de l’intestin grêle :
   1. Ajouter 4 mL de liquide intestinal simulé (SIF) contenant (dans le mmol L-1) : KCl, 6,8 ; KH₂PO₄, 0,8 ; NaHCO₃, 85 ; NaCl, 38,4 ; MgCl₂(H₂O)₆, 0,33 ; HCl, 8,4 ; CaCl₂(H₂O)₂, 0,3, au tube digestif.
   2. Ajustez à un pH 7 avec 1 M de NaOH, si besoin. Incuber à 37 °C et 100 tr/min. Prélève un échantillon de 2 mL (S3).

6. Capacité de colonisation bactérienne après des conditions de transit gastro-intestinal in vitro

1. Centrifugez 2 mL de digestion de l’intestin grêle pendant 10 minutes à 2 650 x g.
2. Retirez le surnageant et mélangez le pellet bactérien avec 5 mL de DMEM supplémenté sans antibiotiques ni antimycotiques.
3. Teindre et quantifier les cellules intactes/endommagées à l’aide d’un cytomètre à flux (voir Tableau des matériaux).
4. Ajustez la densité cellulaire à 10⁵ cellules viables/mL en diluant du DMEM supplémenté sans antibiotiques ni antimycotiques.
5. Retirez le milieu apical du système transwell et ajoutez 1,5 mL de suspension bactérienne. Co-culture du système pendant 2 h dans des conditions générales de culture cellulaire (37 °C, 95 % d’humidité, 5 % de CO₂).
   REMARQUE : Ce temps peut être prolongé jusqu’à 48 heures, selon le protocole expérimental requis. La co-culture peut être maintenue dans un incubateur différent de celui utilisé pour l’entretien cellulaire de routine, afin d’éviter les contaminations.
6. Mesurez les valeurs TEER après incubation pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale comme décrit dans la section 4.11.
7. Après avoir terminé le temps d’incubation, retirer le milieu apical et collecter 0,5 mL pour des analyses ultérieures (S4). Un sous-échantillon de milieu peut être utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire par un test de lactate déshydrogénase (LDH) (voir Tableau des matériaux), suivant les instructions du fabricant.
8. Ajoutez 0,5 mL de 10 mM N-acétylcystéine dans un HBSS (tampon NAC) pour solubiliser le mucus produit par le HT29-MTX et récupérer les bactéries adhérées. Incuber les plaques à 37 °C pendant 1 heure, sous agitation (135 tr/min, voir Tableau des matériaux).
9. Récupérez le NAC-HBSS dans un tube microcentrifuge (S5) et lavez les cellules deux fois avec 1 mL de DPBS.
10. Ajoutez 0,5 mL de 0,5 % de Triton X-100 (v/p) au-dessus des monocouches, perturbez les cellules en pipettant, récupérez le liquide et faites un vortex pendant 1 minute. La rapidité est cruciale pour éviter d’endommager les cellules bactériennes avec le détergent.
11. Centrifugez les cellules pendant 5 minutes à 2 650 x g, puis séparez le surnageant (S6) et la pellete (S7).

7. Analyse d’échantillons

REMARQUE : Analysez les échantillons collectés (S1-S7) afin d’évaluer la viabilité bactérienne et le potentiel d’adhésion aux cellules intestinales, après une digestion gastro-génitale simulée.

1. Viabilité bactérienne : Passer deux fois les échantillons S1-S5 à travers un filtre de 0,45 μm et quantifier les cellules bactériennes à l’aide de coloration des cellules vivantes/mortes et de cytométrie en flux, comme indiqué à l’étape 2.8.
2. Potentiel d’adhérence : Préparez des dilutions en série (-1 à -8) pour S1-S6 et tracez 10 μL dans l’agar sanguin et les plaques BHI modifiées. Incuber à 37 °C dans des conditions anaérobies pendant 24 à 48 heures. Placez le même volume de S7 non dilué.
   1. Identification taxonomique des bactéries adhérées :
      1. Choisissez chaque colonie individuelle avec une boucle de culture et resuspendez-les chacune dans 10 μL d’eau sans nucléase. Collectez 4 μL de cette suspension et utilisez-les comme modèle pour l’amplification par PCR du gène 16S rRNA en utilisant les amorces et conditions décrites dans la version 2.7.1.
      2. Effectuer le séquençage suivant le protocole de la 2.7.3, et valider la séquence en utilisant la procédure incluse dans la 2.7.4.
3. Effectuer des analyses supplémentaires en aval telles que l’extraction totale d’ADN, la quantification par qPCR, et/ou le séquençage des amplicons à ARNr 16S, l’extraction d’ARN et le profilage transcriptomique selon les souhaits.
   REMARQUE : La quantification par cytométrie en flux a été réalisée immédiatement après l’échantillonnage. En contrôle des cellules perméabilisées par membrane, un échantillon exposé à 70 °C pendant 3 minutes a été utilisé. Le bruit de fond a été évalué en mesurant à l’aide de cytométrie en flux les fluides digestifs ou les échantillons obtenus à partir du modèle de culture cellulaire sans bactéries. Chaque échantillon a été mesuré en triple exemplaire.

 

Tableau 1 : Description des lignées cellulaires et de la composition du milieu pour le maintien en culture cellulaire.

Culture cellulaire	Adhérent / Suspension	Milieu de culture	Suppléments généraux	Suppléments spécifiques	Doublement du temps	Conditions d’incubation
Caco-2 (ECACC 86010202)	Adhérent	Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose	Sérum bovin fœtal inactivé (10 % v/v) Pénicilline (100 U/mL)* Streptomycine (0,1 mg/mL)* Amphotéricine (0,0025 mg/mL)*	Glutamax (4 mM) Acides aminés non essentiels (1 % v/v) Pyruvate (1 mM)	65–72 h	Incubateur à 95 % d’humidité et 10 %CO2 CO2 (voir Tableau des matériaux)
HT29-MTX (ECACC 12040401)	Adhérent			HEPES (1 mM)	20–24 h
* Les antibiotiques et antifongiques ont été retirés du milieu de culture cellulaire 2 jours avant le début des tests.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
TENSIONS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	Collection de la culture de type américain	ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum	Collection de la culture de type américain	ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis	Collection de la culture de type américain	ATCC 33277
Prevotella intermedia	Collection de la culture de type américain	ATCC 25611
Streptococcus mutans	Collection de la culture de type américain	ATCC 25175
Streptococcus sobrinus	Collection de la culture de type américain	ATCC 33478
Actinomyces viscosus	Collection de la culture de type américain	ATCC 15987
Streptococcus salivarius TOVE-R
Streptococcus mitis	Collection de la culture de type américain	ATCC 49456
Streptococcus sanguinis	Collection de bactéries BCCM/LMG	LMG 14657
Veillonella parvula	Institut Leibniz DSMZ - Collection allemande de micro-organismes et cultures cellulaires	DSM 2007
Streptococcus gordonii	Collection de la culture de type américain	ATCC 49818
LIGNÉES CELLULAIRES
Cellules Caco-2	Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées	86010202
Cellules HT29-MTX	Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées	12040401
RÉACTIFS ET CONSOMMABLES
Bouillon Brain Heart Infusion (BHI)	Oxoïde	CM1135
Blood Agar 2	Oxoïde	CM0055	Milieu d’agar sanguin
Menadione	Sigma	M9429
Hemin	Sigma	H9039
5 % de sang de cheval défibriné stérile	E&O Laboratories Ltd,	P030
InnuPREP PCRpure Kit	Analytik Jena	845-KS-5010250	Kit de purification PCR
Big Dye	Biosystèmes appliqués	4337454	Colorant pour le séquençage
Kit de séquençage de cycle ABI Prism BigDye Terminator v3.1	Biosystèmes appliqués	4337456
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
Iodure de propidium	Invitrogen	P1304MP
Fioles de culture T25 non enrobées, traitées en culture cellulaire, ventilées, stériles	VWR	734-2311
Solution de trypsine-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Solution Trypan Blue0,4 %, liquide, filtré stérile	Sigma-Aldrich	T8154
Phosphate tampon salin (PBS)	Gibco	14190250
Milieu de culture cellulaire DMEM, avec GlutaMAX et Pyruvate	Technologies de vie	31966-047
Inserts de culture cellulaire à membrane polyester Corning Transwell	Sigma-Aldrich	CLS3450-24EA
Mucine provenant de l’estomac porcin de type II	Sigma-Aldrich	M2378
Sérum fœtal bovin inactivé	Greiner Bio One	758093
Antibiotique-Antimycotique (100X)	Gibco	15240062
Triton X 100 pour la biologie moléculaire	Sigma-Aldrich	T8787
DPBS sans calcium, magnésium	Gibco	14190-250
Kit de test de cytotoxicité Pierce LDH	Thermo Fisher Scientific	88953
Puits Corning HTS Transwell-24, taille des pores 0,4 μm	Corning Costar Corp	3450
Eau sans nucléase	Électrophorèse Serva	28539010
ÉQUIPEMENT
Amélioration de la chambre de comptage de Neubauer	Carl Roth	T729.1
Cytomètre de débit BD Accuri C6	BD Biosciences	653118
Homogénéiseur PowerLyzer 24	MoBio	13155
Cycleur thermique T100	BioRad	186-1096
Système de chasse	Sur mesure	-
Shaker incubateur InnOva 4080	École scientifique du Nouveau-Brunswick	8261-30-1007	Shaker pour 2.10
Incubateur de CO₂ Memmert	Memmert GmbH & Co.	ICO150med
Millicell ERS (Système de résistance électrique)	EMD Millipore, Merck KGaA	MERS00002
Millipore Milli-Q académique, système d’eau ultra pure	Millipore, Merck KGaA	-
Shaker (ROCKER 3D de base)	IKA	4000000	Shaker pour 6.10