Modèle intestinal in vitro pour évaluer l’adhésion et l’internalisation bactériennes

Résumé

Source : Calatayud Arroyo, M., et al. Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique à l’interface intestin-microbe in vitro. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente un modèle intestin-microbe in vitro pour étudier la viabilité bactérienne. Une co-culture de cellules Caco-2 et HT29-MTX est incubée avec des bactéries pré-traitées dans des conditions digestives simulées. L’intégrité de la barrière épithéliale est évaluée à l’aide de résistance électrique transépithéliale, et des fractions du milieu, du mucus solubilisé, du lysat cellulaire et des débris cellulaires sont collectées pour une analyse en aval.

Protocole

1. Souches et conditions de culture

REMARQUE : La communauté orale synthétique était composée de souches couramment présentes dans le microbiome oral.

1. Obtenez les souches suivantes à partir de l’American Type Culture Collection (ATCC) : Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 4....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
TENSIONS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	Collection de la culture de type américain	ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum	Collection de la culture de type américain	ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis	Collection de la culture de type américain	ATCC 33277
Prevotella intermedia	Collection de la culture de type américain	ATCC 25611
Streptococcus mutans	Collection de la culture de type américain	ATCC 25175
Streptococcus sobrinus	Collection de la culture de type américain	ATCC 33478
Actinomyces viscosus	Collection de la culture de type américain	ATCC 15987
Streptococcus salivarius TOVE-R
Streptococcus mitis	Collection de la culture de type américain	ATCC 49456
Streptococcus sanguinis	Collection de bactéries BCCM/LMG	LMG 14657
Veillonella parvula	Institut Leibniz DSMZ - Collection allemande de micro-organismes et cultures cellulaires	DSM 2007
Streptococcus gordonii	Collection de la culture de type américain	ATCC 49818
LIGNÉES CELLULAIRES
Cellules Caco-2	Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées	86010202
Cellules HT29-MTX	Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées	12040401
RÉACTIFS ET CONSOMMABLES
Bouillon Brain Heart Infusion (BHI)	Oxoïde	CM1135
Blood Agar 2	Oxoïde	CM0055	Milieu d’agar sanguin
Menadione	Sigma	M9429
Hemin	Sigma	H9039
5 % de sang de cheval défibriné stérile	E&O Laboratories Ltd,	P030
InnuPREP PCRpure Kit	Analytik Jena	845-KS-5010250	Kit de purification PCR
Big Dye	Biosystèmes appliqués	4337454	Colorant pour le séquençage
Kit de séquençage de cycle ABI Prism BigDye Terminator v3.1	Biosystèmes appliqués	4337456
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
Iodure de propidium	Invitrogen	P1304MP
Fioles de culture T25 non enrobées, traitées en culture cellulaire, ventilées, stériles	VWR	734-2311
Solution de trypsine-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Solution Trypan Blue0,4 %, liquide, filtré stérile	Sigma-Aldrich	T8154
Phosphate tampon salin (PBS)	Gibco	14190250
Milieu de culture cellulaire DMEM, avec GlutaMAX et Pyruvate	Technologies de vie	31966-047
Inserts de culture cellulaire à membrane polyester Corning Transwell	Sigma-Aldrich	CLS3450-24EA
Mucine provenant de l’estomac porcin de type II	Sigma-Aldrich	M2378
Sérum fœtal bovin inactivé	Greiner Bio One	758093
Antibiotique-Antimycotique (100X)	Gibco	15240062
Triton X 100 pour la biologie moléculaire	Sigma-Aldrich	T8787
DPBS sans calcium, magnésium	Gibco	14190-250
Kit de test de cytotoxicité Pierce LDH	Thermo Fisher Scientific	88953
Puits Corning HTS Transwell-24, taille des pores 0,4 μm	Corning Costar Corp	3450
Eau sans nucléase	Électrophorèse Serva	28539010
ÉQUIPEMENT
Amélioration de la chambre de comptage de Neubauer	Carl Roth	T729.1
Cytomètre de débit BD Accuri C6	BD Biosciences	653118
Homogénéiseur PowerLyzer 24	MoBio	13155
Cycleur thermique T100	BioRad	186-1096
Système de chasse	Sur mesure	-
Shaker incubateur InnOva 4080	École scientifique du Nouveau-Brunswick	8261-30-1007	Shaker pour 2.10
Incubateur de CO₂ Memmert	Memmert GmbH & Co.	ICO150med
Millicell ERS (Système de résistance électrique)	EMD Millipore, Merck KGaA	MERS00002
Millipore Milli-Q académique, système d’eau ultra pure	Millipore, Merck KGaA	-
Shaker (ROCKER 3D de base)	IKA	4000000	Shaker pour 6.10