$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Isoler l’ADN génomique des tissus végétaux à l’aide d’un kit d’extraction génomique
- Obtenez du tissu foliaire d’agrumes en coupant une feuille entière fraîche d’un agrume à l’aide de ciseaux propres, puis placez la feuille dans un sac plastique propre.
REMARQUE : Le sac contenant le tissu foliaire doit être placé dans un réfrigérateur à 4 °C ou sur glace dans un contenant isolé dès que possible après la collecte afin d’éviter toute détérioration. - Ajoutez une petite quantité d’azote liquide pour refroidir un mortier et pilon. Pendant qu’ils sont au frais, utilisez des ciseaux pour découper un petit morceau de tissu foliaire, d’environ 1 pouce carré. Placez le tissu coupé dans le mortier pour le congeler instantanément. Ajoutez plus d’azote liquide, si besoin.
REMARQUE : Les gants isolants doivent toujours être portés lors de la manipulation de l’azote liquide. - Broyez rapidement les tissus végétaux en une fine poudre à l’aide du mortier. Continuez à broyer jusqu’à ce que l’azote liquide s’évapore complètement, et qu’il reste une fine poudre verte.
- Refroidissez brièvement une spatule métallique dans de l’azote liquide pendant 10 à 15 secondes, puis ramassez le tissu moulu à l’intérieur du mortier dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, à l’aide de la spatule.
- Ajoutez 600 μL de solution de lyse des noyaux (voir tableau des matériaux) à l’aide d’une pipette de 1000 μL. Faites passer l’échantillon en vortex pendant 1 à 3 secondes, puis incubez dans un bain marie à 65 °C pendant 15 minutes.
- Ajoutez 3 μL de solution RNase au lysat à l’aide d’une pipette de 10 μL, inversez le tube 2 à 5 fois pour le mélanger, puis faites couver à 37 °C dans un incubateur en cabinet pendant 15 minutes.
REMARQUE : Laissez le mélange refroidir à température ambiante avant de continuer. - Ajoutez 200 μL de solution de précipitation protéique, faites passer un vortex à grande vitesse pendant 20 s, puis centrifugez pendant 3 minutes à 13 000 x g pour former un pellet ferme. Pendant la centrifugation, ajoutez 600 μL d’isopropanol à température ambiante dans un tube de microcentrifugation neuf de 1,5 mL.
- À l’aide d’une pipette de 1000 μL, retirez soigneusement le surnageant de l’échantillon centrifugé, en le transférant dans le tube de microcentrifugation neuf de 1,5 mL contenant de l’isopropanol. La pastille peut désormais être jetée.
REMARQUE : Évitez de contaminer le surnageant avec des protéines en laissant une infime quantité de surnageant au-dessus du pellet. - Inversez le tube jusqu’à ce que l’ADN devienne visible sous forme de masse de filaments filamenteux, puis centrifugez à 13 000 x g pendant 1 minute à température ambiante.
- Décantez le surnageant, ajoutez 600 μL d’éthanol à 70 % au pellet, inversez le tube plusieurs fois pour laver l’ADN, puis centrifugez à 13 000 x g pendant 1 minute.
- Aspirez soigneusement l’éthanol en laissant la granule d’ADN lâche, puis ouvrez et inversez le tube, reposant sur du papier absorbant. Faites sécher à l’air à température ambiante pendant 15 minutes.
- Ajoutez 100 μL de solution de réhydratation à l’ADN à la granule d’ADN séchée, puis faites couver l’ADN dans un bain-marie à 65 °C pendant 1 heure, tout en mélangeant périodiquement en tapotant le tube.
- Placez 1 μL d’eau purifiée dans une microcuvette, puis insérez-la dans un spectrophotomètre pour l’utiliser comme un blanc. Calculez la concentration d’ADN présent en plaçant 1 μL de l’échantillon dans la microcuvette et en l’insérant dans le spectrophotomètre. La concentration d’ADN (ng/μL) peut être calculée comme (A260 - A320) × facteur de dilution × 50 ng/μL.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. L’échantillon peut être stocké à 4 °C.