Ce vidéo montre la production de pseudovirus de la grippe dans des cellules humaines par transfection de plasmide médiée par le phosphate de calcium, permettant la génération sécuritaire de particules virales à cycle unique pour des applications ultérieures telles que les dosages de neutralisation d'anticorps dans des conditions de niveau de biosécurité 2.
Article de méthode
Production de pseudovirus par transfection plasmidique dans des cellules humaines
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31 août 2026
Dans cet article
Résumé
Protocole
1. Conditionnement de pseudovirus par transfection au phosphate de calcium
- Préparer des suspensions monocellulaires de cellules HEK293FT (9 x 105 par mL) dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) complet (Tableau 1). Ajouter 10 mL de la suspension monocellulaire dans un flacon T75 et incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone (CO2) pendant 20 h avant la transfection.
REMARQUE : Il est recommandé d'utiliser des HEK293FT à faible passage (<20 passages). S'assurer que la monocouche cellulaire est confluente à 80-90 %. - Remplacer le milieu par 10 mL de milieu complet frais contenant de la chloroquine (100 µM) 2 h avant la transfection.
- Mélanger les réactifs et l'ADN plasmidique comme indiqué dans le Tableau 2 et la Figure 1 : ddH2O (eau doublement distillée), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, CaCl2 (chlorure de calcium) à 2,5 M et tampon HEPES 2x (4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique). Pipeter doucement 5 fois vers le haut et vers le bas ; incuber le mélange à température ambiante (TA) pendant 20 min.
- Transférer le mélange dans le milieu au-dessus des cellules et agiter doucement le flacon. Incuber les cellules dans l'incubateur cellulaire pendant 15 h.
- Remplacer le milieu par 15 mL de milieu DMEM complet frais. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 65 h.
REMARQUE : La couleur du milieu sera orangée claire ou légèrement jaune, et au moins 80 % des cellules doivent présenter un effet cytopathogène (CPE) au microscope inversé. - Récupérer le surnageant et le centrifuger à 2095 x g pendant 20 min à 4 °C. Collecter le surnageant, le fractionner en aliquots et le stocker à -80 °C.
Tableau 1 : Composition du milieu DMEM complet.
| Composition du milieu DMEM complet | Concentration |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Sérum de veau fœtal | 10% |
| Pénicilline (1 U/mL)/Streptomycine | 1 μg/ mL |
Tableau 2 : Système d’emballage de pseudovirus.
| Matériaux | Concentration | Volume |
| 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675.0 μL |
| CaCl2 (2.5 M) | -- | 67.5 μL |
| ddH2O | -- | 529.2 μL |
| pCMV Δ 8.9 | 1000 ng/μL | 18.9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27.0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13.5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18.9 μL |
Résultats
Figure 1 : Organigramme de la transfection par le calcium. Cet organigramme sert à décrire les principales étapes de la transfection par le calcium.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorure de calcium anhydre | AMRESCO | 1B1110-500G | Réactif |
| Chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Réactif |
| DMEM (milieu de Dulbecco modifié par Eagle) | Gibco | 12100-046 | Réactif |
| Sérum de veau fœtal | Gibco | 16000-044 | Réactif |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Ligne cellulaire |
| Acide HEPES sans sel | AMRESCO | 0511-250G | Réactif |
| Kit ELISA pour l'antigène p24 du VIH-1 | ZeptoMetrix | 801111 | Kit de réactifs |
| Emballage réfrigérant pour système de dosage de la luciférase | Promega | E4530 | Kit de réactifs |
| Tubes microcentrifuges 1,5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | Matériau consommable |
| Tubes coniques de centrifugeuse Nunc 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | Matériau consommable |
| Pénicilline-streptomycine | Gibco | 15140-122 | Réactif |
| Pointes de pipette (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | Matériau consommable |
| Pointes de pipette (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | Matériau consommable |
| Pointes de pipette (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | Matériau consommable |
| Pipettes serologiques (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | Matériau consommable |
| Pipettes serologiques (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | Matériau consommable |
