Silençage des microARN basé sur le Virus X de la pomme de terre chez les plants de pomme de terre

Dans cet article

Résumé

Source : Zhao, J., et al. Inhibition de microARN basé sur le virus X de la pomme de terre (VbMS) chez la pomme de terre. J. Vis. Exp. (2020).

Ce vidéo montre l'utilisation de Agrobacterium tumefaciens pour délivrer un vecteur basé sur le virus X de la pomme de terre (PVX) à des plants de pomme de terre cultivés in vitro, afin d'induire un silençage des microARN fondé sur un virus (VbMS). La méthode permet une suppression systémique d'un microARN cible, permettant aux chercheurs d'étudier son rôle dans le développement végétal par l'observation de modifications phénotypiques.

Protocole

1. Réaliser le test VbMS basé sur le PVX chez les plants de pomme de terre.

Transplanter des plants de pomme de terre in vitro âgés de 4 semaines en pleine terre. Les plants transplantés seront soumis à un test VbMS 3 à 4 jours plus tard.
Inoculer les plants de pomme de terre avec Agrobacterium contenant les plasmides PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic).
REMARQUE : Pour le test VbMS chez la pomme de terre, l'infiltration médiée par Agrobacterium et l'inoculation par griffage avec un cure-dent sont réalisées simultanément.
1. Choisir et inoculer les transformants positifs contenant les vecteurs PVX-STTM dans 50 mL de milieu LB liquide contenant 50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine. Faire croître à 28 °C dans un incubateur à 220 tr/min pendant 16 h jusqu'à une OD₆₀₀ = 1,0.
2. Simultanément, étaler les colonies positives d'Agrobacterium sur au moins deux nouvelles boîtes de Pétri LB contenant 50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine, puis faire croître à 28 °C pendant 1 jour. Inclure le vecteur PVX-LIC comme témoin et PVX-GFP pour surveiller la propagation du virus.
3. Récupérer la culture liquide d'Agrobacterium par centrifugation à 3 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Resuspendre les cellules d'Agrobacterium dans un volume égal de tampon d'infiltration (10 mM MgCl₂, 10 mM MES et 200 µM d'acétosyringone, pH = 5,6) et ajuster à une OD₆₀₀ = 1,0. Incuber à température ambiante pendant 6 h.
4. Infiltrer la culture d'Agrobacterium sur la face abaxiale des feuilles complètement étendues à l'aide d'une seringue de 1 mL sans aiguille.
  1. Retourner et tenir une feuille avec une main, puis utiliser un doigt pour soutenir le limbe foliaire par la face adaxiale au site d'infiltration. Garder la seringue perpendiculaire à la surface de la feuille avec l'autre main et infiltrer la culture d'Agrobacterium sur la face abaxiale du limbe.
5. Prélever la culture d'Agrobacterium des boîtes de Pétri LB et griffer la surface de la tige au niveau du premier ou des deux premiers entrenœuds des plants de pomme de terre infiltrés à l'aide d'un cure-dent. Griffer doucement l'épiderme de la tige. Éviter de percer complètement la tige, ce qui pourrait causer de graves dommages aux plants.
Faire croître les plants infiltrés à 22 °C avec un photopériode de 16 h de lumière / 8 h d'obscurité et une intensité lumineuse de 120 μmol/m²∙ s¹ en serre.
REMARQUE : Les phénotypes induits par la silenciation des miARN apparaissent généralement 2 à 4 semaines après l'inoculation (Figure 1, Figure 2). Il faut généralement 10 à 20 jours pour que le phénotype VbMS apparaisse après l'infiltration. Le phénotype VbMS dépend des propriétés du miARN spécifique et des gènes cibles, des conditions de croissance et des variétés de pomme de terre.

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Résultats

Figure 1 : SdMV de miR165/166 dans la variété de pomme de terre tétraploïde Katahdin. Phénotypes des plantes de pomme de terre (Katahdin) exprimant le contrôle du vecteur PVX ou PVX-STTM165/166. Les flèches magenta indiquent des structures ...