Préparation de cryosections rétiniennes de souris pour évaluer la perméabilité rétinienne aux virus adéno-associés

Résumé

Source : Vacca, O., et al. Utilisation du virus adéno-associé comme outil pour étudier les barrières rétiniennes dans les maladies. J. Vis. Exp. (2015)

Ce vidéo montre la procédure étape par étape pour préparer des cryosections rétiniennes de souris afin de visualiser la perméabilité du virus adéno-associé à travers les barrières rétiniennes altérées.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons animaux ont été examinées et approuvées par le comité d'éthique animal approprié. 

1. Pour des cryosections rétiniennes (Figure 1), disséquer les yeux énucléés afin d’enlever le cristallin et la cornée, puis les fixer par immersion dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 heure.
   1. Protéger à froid les yeux préalablement fixés dans du saccharose à 10 % pendant 1 heure à température ambiante, puis dans du saccharose à 20 % pendant encore 1 heure à température ambiante. Protéger à froid dans une solution de saccharose à 30 %, pendant la nuit à 4 °C. Congeler et inclure les cupules oculaires dans une résine d'inclusion telle que Cryo-matrix. Réaliser des cryosections de 10 µm et les monter sur des lames spécialement traitées pour les sections de tissus congelés et qui améliorent l'adhérence du tissu pendant la coloration.
   2. Perméabiliser les sections avec du Triton X-100 à 0,1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4 pendant 5 minutes. Laver 2 fois dans le PBS et bloquer pendant 1 heure à température ambiante dans du PBS contenant 1 % d'albumine sérique bovine (BSA) et 0,1 % de Tween 20.

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique du protocole général. Après la production du virus associé aux adénovirus (AAV), les particules sont injectées dans le vitré ou dans la veine péniennes afin d'anesthésier des souris adultes. Des images du fond d'œil sont réalisées à l'aide d'une caméra Micron III pour suivre l'expression de la protéine verte fluorescente (GFP). Le profil d'expression de la GFP est analysé sur des cryosections rétiniennes et des rétines montées à plat grâce à l'immunohistochimie et aux images confocales. Le passage du AAV à travers la barrière hématorétinienne (BRB) est évalué par analyse en réaction en chaîne par polymérase (PCR) sur des échantillons sanguins provenant de souris injectées par voie intravitréenne ou intrapéritonéale, afin de détecter la présence de la séquence GFP, indicatrice de la présence de particules AAV dans la circulation sanguine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Résine d'inclusion Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006
Lames adhésives Superfrost plus	Thermo Scientific	10143352
Loupe binoculaire SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0,66 x 5 x LED avec support épi et dia / Dissection des rétines
Ciseaux à ressort droits - 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Dissection rétinienne