Préparation de cryosections rétiniennes de souris pour évaluer la perméabilité rétinienne aux virus adéno-associés

Dans cet article

Résumé

Source : Vacca, O., et al. Utilisation du virus adéno-associé comme outil pour étudier les barrières rétiniennes dans les maladies. J. Vis. Exp. (2015)

Ce vidéo montre la procédure étape par étape pour préparer des cryosections rétiniennes de souris afin de visualiser la perméabilité du virus adéno-associé à travers les barrières rétiniennes altérées.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons animaux ont été examinées et approuvées par le comité d'éthique animal approprié.

Pour des cryosections rétiniennes (Figure 1), disséquer les yeux énucléés afin d’enlever le cristallin et la cornée, puis les fixer par immersion dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 heure.
1. Protéger à froid les yeux préalablement fixés dans du saccharose à 10 % pendant 1 heure à température ambiante, puis dans du saccharose à 20 % pendant encore 1 heure à température ambiante. Protéger à froid dans une solution de saccharose à 30 %, pendant la nuit à 4 °C. Congeler et inclure les cupules oculaires dans une résine d'inclusion telle que Cryo-matrix. Réaliser des cryosections de 10 µm et les monter sur des lames spécialement traitées pour les sections de tissus congelés et qui améliorent l'adhérence du tissu pendant la coloration.
2. Perméabiliser les sections avec du Triton X-100 à 0,1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4 pendant 5 minutes. Laver 2 fois dans le PBS et bloquer pendant 1 heure à température ambiante dans du PBS contenant 1 % d'albumine sérique bovine (BSA) et 0,1 % de Tween 20.

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Résultats

Figure 1 : Représentation schématique du protocole général. Après la production du virus associé aux adénovirus (AAV), les particules sont injectées dans le vitré ou dans la veine péniennes afin d'anesthésier des souris adultes. Des images d...