Délivrance de gènes médiée par AAV pour la visualisation de l'altération de l'intégrité de la membrane rétinienne

Résumé

Source : Vacca, O., et al. Utilisation du virus adéno-associé comme outil pour étudier les barrières rétiniennes dans les maladies. J. Vis. Exp. (2015).

Ce vidéo montre la méthode de transfert génique médiée par AAV dans une rétine de souris transgénique, suivie de la dissection et de la coloration du tissu pour évaluer l'intégrité de la membrane limitante interne.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons animaux ont été examinées et approuvées par le comité d'éthique animal approprié.

1. Immunohistochimie

1. Pour les montages plats de rétine (Figure 1), fixer les yeux énucléés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min afin de faciliter la dissection.
   1. En 15 à 30 min, disséquer les yeux pour enlever la cornée et le cristallin. Séparer la rétine de l'épithélium pigmentaire de la rétine (RPE) et de la sclère en coupant autour de l'ora serrata et du nerf optique. Plonger dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant encore 30 min pour fixer la rétine et la protéine fluorescente dans les cellules rétiniennes transduites (la fixation ne doit pas dépasser 24 h). Rincer 5 min dans du PBS stérile, pH 7,4.
   2. Remplacer le tampon phosphate-saline (PBS) par le tampon de blocage (PBS contenant 1 % d'albumine de sérum bovin (BSA), 2 % de sérum de chèvre ou d'âne normal, 0,5 % de Triton X-100) et incuber dans le tampon de blocage pendant 4 h à température ambiante ou à 4 °C toute la nuit.
2. Incuber les tissus avec les anticorps primaires dans un tampon de blocage pendant 4 h à température ambiante ou à 4 °C toute la nuit. Rincer 3 fois avec du PBS.
   REMARQUE : Les anticorps utilisés sont les suivants : anti-lamine (1/1 000) marquant les membranes limitantes internes (ILM), anticorps anti-rhodopsine clone 4D2 (1/500) marquant les bâtonnets, anticorps anti-glutamine synthétase clone GS-6 (1/1 500) marquant les cellules de Müller, lectine de l'agglutinine d'arachide (PNA) (1/40) marquant les cônes.
3. Incuber les tissus avec une dilution 1:500 d'anticorps secondaires conjugués à l'Alexa Fluor dans le tampon de blocage pendant 1 h (coupes cryogéniques) ou 2 h (montages plats) à température ambiante et à l'abri de la lumière. Rincer 3 fois avec du PBS.
4. Effectuer des incisions de décharge sur la rétine et la monter à plat sur une lame de verre, avec la face des photorécepteurs ou celle des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) orientée vers le haut. Ajouter un milieu de montage aqueux, poser une lamelle et conserver à 4 °C.
5. Réaliser la microscopie confocale sur un microscope confocal à balayage laser. Acquérir les images séquentiellement, ligne par ligne, afin de réduire les interférences d'excitation et d'émission. Définir la taille du pas selon le théorème d'échantillonnage de Nyquist-Shannon. Utiliser des réglages d'exposition qui minimisent les pixels sur-saturés dans les images finales. Traiter les images en 12 bits avec FIJI, projeter les sections en Z sur un plan unique en utilisant l'intensité maximale dans la fonction Z-project, puis convertir finalement en mode couleur RVB 8 bits.

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique du protocole général. Après la production des AAV, les particules sont injectées dans le vitré ou dans la veine péniennne pour anesthésier des souris adultes. Des images du fond d’œil sont réalisées à l’aide d’une caméra Micron III afin de suivre l’expression de la GFP (protéine verte fluorescente). Le profil d’expression de la GFP est analysé sur des cryosections rétiniennes et des rétines montées à plat grâce à l’immunohistochimie et à des images confocales. Le passage des AAV à travers la BRB est évalué par analyse PCR d’échantillons sanguins provenant de souris ayant reçu une injection intravitréenne ou intrapéniennne, afin de détecter la présence de la séquence GFP, indicatrice de la présence de particules AAV dans la circulation sanguine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lames Superfrost Plus adhésives	Thermo Scientific	10143352	Lames
Anti-lamine	Sigma	L9393	Anticorps
Anti-rhodopsine clone 4D2	Millipore	MABN15	Anticorps
Anti-glutamine synthétase clone GS-6	Millipore	MAB302	Anticorps
Anti-protéine acide fibrillaire gliale	Dako	334	Anticorps
Lectine PNA	Invitrogen	L32459	Sonde
anticorps secondaires conjugués à l'Alexa Fluor	Invitrogen		Anticorps
Réactif Fluorsave	Calbiochem	345789	Milieu de montage
Colorant bleu d'Évans	Sigma	E2129	Colorant
Spectrophotométrie du formamide	Sigma	295876-2L
Fluorescéine	Sigma	F2456	Colorant
Micron III	Phoenix Research Labs		Un système de microscopie basé sur une caméra couleur 3-CCD, une carte de capture d'images et un logiciel standard permet aux chercheurs d'acquérir des images de rétines de souris.
Binoculaire loupe SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0,66 x 5 x LED avec support, épi et dia / Dissection des rétines
Ciseaux droits à ressort - 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Dissection de la rétine