Production et purification de particules du virus de l'hépatite B recombinant

Résumé

Source : Nishitsuji, H., et al. Développement d'un système rapporteur du virus de l'hépatite B pour surveiller les premières étapes du cycle de réplication. J. Vis. Exp. (2017)

Ce vidéo montre la production et la purification de particules virales recombinantes du virus de l'hépatite B, permettant ainsi l'obtention de préparations virales sûres et déficientes en réplication pour l'étude des événements précoces d'infection et pour des applications de criblage à haut débit de médicaments antiviraux.

Protocole

1. Production du VHB recombinant (virus de l'hépatite B) codant pour la protéine rapporteuse

1. Préparation des cellules HepG2
   1. Préparer le milieu de culture cellulaire (milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM) complété avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 U/ml de pénicilline, 100 µg/ml de streptomycine et 100 U/ml d'acides aminés non essentiels).
   2. Ensemencer 4 x 10⁶ cellules HepG2 (carcinome hépatocellulaire humain G2) dans une boîte de 10 cm revêtue de collagène avec 10 ml de milieu de culture la veille de la transfection. Incuber les cellules HepG2 à 37 °C dans un incubateur humide avec 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Lorsque environ 4 x 10⁶ cellules HepG2 sont ensemencées dans une boîte de 10 cm revêtue de collagène avec 10 ml de milieu de culture, elles atteindront une confluence de 70 à 90 % le lendemain.
2. Transfection
   1. Transfecter les cellules HepG2 avec 5 µg de pUC1.2HBV delta epsilon15 (un plasmide de réplication de l'HBV comportant une délétion dans la séquence epsilon) et 5 µg de pUC1.2HBV/NL15 en utilisant un réactif de transfection selon les instructions du fabricant.
   2. Le jour suivant, retirer le milieu de culture et ajouter 10 ml de milieu de culture frais.
   3. Une semaine après la transfection, transférer le milieu de culture contenant l'HBV recombinant dans un tube de 50 ml et passer à l'étape 1.3.1. Ajouter 10 ml de milieu de culture frais dans la boîte contenant les cellules transfectées.
      REMARQUE : La production de l'HBV recombinant est maintenue pendant 4 semaines. Le milieu de culture contenant l'HBV recombinant peut être conservé à 4 °C pendant 1 mois.
3. Purification de l'HBV recombinant
   1. Éliminer les débris cellulaires du milieu de culture contenant l'HBV recombinant par centrifugation (2 300 x g pendant 5 min).
   2. Filtrer le surnageant à travers un filtre membranaire de 0,45 µm.
   3. Ajouter un volume égal de PEG 26 % / NaCl 1,5 M (polyéthylène glycol 6000 : 130 g, NaCl (chlorure de sodium), 49 g, 1 ml de EDTA 0,5 M (acide éthylènediaminotétraacétique) pH 8,0 et 5 ml de HEPES 1 M (N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique) pH 7,6 dans 500 ml) au milieu de culture contenant l'HBV recombinant et mélanger doucement. Incuber toute la nuit à 4 °C.
   4. Centrifuger à 2 300 x g pendant 20 min à 4 °C.
   5. Jeter le surnageant et dissoudre le culot dans 0,5 ml de TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
   6. Éliminer les débris par centrifugation à 2 300 x g pendant 5 min.
   7. Déposer 0,5 ml de TNE contenant l'HBV recombinant sur 0,8 ml de saccharose 20 % dans le TNE.
   8. Centrifuger à 100 000 × g pendant 3 h à 15 °C.
   9. Jeter autant que possible du surnageant et conserver le culot. Le resuspendre dans 1 ml de DMEM sans sérum par 40 ml de milieu de culture initial.
   10. Incuber toute la nuit à 4 °C.
   11. Filtrer à travers un filtre de 0,45 µm. Préparer des aliquotes de 0,5 ml et conserver à -80 °C.
       REMARQUE : Si une contamination par la protéine rapporteuse de l'échantillon viral initial est observée, purifier le virus par ultracentrifugation en gradient de densité de saccharose 5-30 % dans le TNE à 100 000 x g pendant 2 h, ou par centrifugation d'équilibre en densité de CsCl (chlorure de césium) de 1,1 à 1,6 g/ml à 150 000 x g pendant 50 h.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif d'essai Nano-Glo Luciferase	Promega	N1110
Solution mixte de pénicilline-streptomycine	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Plaque de 100 mm revêtue de collagène	Iwaki	4020-010
Réactif de transfection Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polymère d'éthylène glycol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polymère d'éthylène glycol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
Solution d'EDTA 0,5 mol/L	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, filtre de 0,45 μm en polyéthersulfone	Merck Millipore	SLHP033RS
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Plaque de 96 puits revêtue de collagène	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-