Visualisation de capsides virales traitées thermiquement par microscopie électronique à transmission

Résumé

Source : Moore, M. D., et al. Méthodes alternatives in vitro pour la détermination de l'intégrité structurale de la capside virale. J. Vis. Exp.(2017).

Ce vidéo montre comment des capsides virales purifiées sont traitées thermiquement, préparées et observées à l'aide de la microscopie électronique en transmission (TEM) afin de révéler les modifications structurales et les dommages induits par la chaleur.

Protocole

1. Préparation des échantillons pour la microscopie électronique en transmission (MET)
   1. Obtenir des grilles en film de support en carbone (nickel) conçues pour la MET.
      REMARQUE : Consulter l'installation centrale concernant les réactifs recommandés et leur manipulation pour une utilisation avec le microscope de l'installation. Veiller à stocker les grilles dans une boîte contenant un desséchant ou dans une chambre sous vide afin de minimiser l'exposition à l'humidité.
   2. Déchirer des morceaux de papier filtre d'environ 5 cm x 5 cm. Se procurer des boîtes de Pétri en verre et des pinces inverses auto-fermantes adaptées à la microscopie.
   3. Couper un morceau de film de paraffine d'environ 2,5 cm x 5 cm. Le placer sur le plan de travail.
   4. Traitement thermique des capsides du norovirus GII.4 Sydney
      1. Obtenir la protéine majeure de la capside purifiée du norovirus humain (VP1) de GII.4 Sydney (Accession : JX459908) assemblée en capsides. 
         REMARQUE : Les capsides utilisées dans cette étude ont été fournies gracieusement par R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
      2. Diluer les capsides dans de l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) 10 mM (pH 7,4) jusqu'à un volume maximal de 15 µL dans des tubes individuels de réaction en chaîne par polymérase (PCR) bouchonnés. S'assurer que chaque tube contient au moins 600 ng de capside. S'assurer qu'il y a 600 ng de capside par combinaison traitement-ligand.
      3. Préchauffer le thermocycleur à la température de traitement souhaitée. 
         REMARQUE : Pour ce protocole, un traitement à 68 °C pendant différentes durées (0 - 25 min) a été choisi.
      4. Préchauffer un thermocycleur supplémentaire à 4 °C pour un refroidissement immédiat. Ajouter les tubes contenant la solution de capsides au thermocycleur pendant la durée souhaitée. Transférer immédiatement après chauffage vers un thermocycleur prérefroidi à 4 °C pendant 5 min.
      5. Faire une courte centrifugation pour faire descendre toutes les gouttelettes au fond du tube.
      6. Prélever au pipetage toute la goutte d'environ 15 µL de solution de capsides traitée et la déposer sur le film de paraffine.
   5. Saisir le bord de la grille avec les pinces, en les laissant se refermer sur le bord pour maintenir la grille, puis placer la grille côté carbone vers le bas sur la goutte de solution traitée. Laisser incuber pendant 10 min afin de permettre aux capsides de s'attacher à la grille.
      1. En fonction de la pureté de la préparation des capsides, ajouter des lavages avec la solution HEPES 10 mM si nécessaire, sous forme de gouttelettes de 10-15 µL placées en ligne après la goutte de capsides traitées.
      2. Après 10 min, reprendre la grille avec la goutte. Placer la grille presque perpendiculairement à un morceau de papier filtre pour absorber la goutte. Prélever la goutte de tampon HEPES de 10 - 15 µL avec la grille, maintenir pendant 30 s, puis absorber avec un autre morceau de papier filtre pour laver.
   6. Déposer une goutte de 15 µL de solution d'acétate d'urayle à 2 % sur le film de paraffine dans une zone vide.
      1. Prélever la goutte d'acétate d'urayle avec la grille et maintenir pendant 45 s. Absorber l'acétate d'urayle en veillant à éliminer la majeure partie de la solution. Placer la grille côté carbone vers le haut sur un morceau de papier filtre, en prenant soin que la grille ne « colle » pas à l'humidité présente sur les pinces. Placer le papier filtre avec la grille dessus dans une boîte de Pétri en verre ouverte.
         REMARQUE : Ne pas utiliser de boîtes de Pétri en plastique, car les grilles seront attirées électrostatiquement et resteront collées au récipient.
   7. Répéter pour tous les traitements. Placer les demi-boîtes de Pétri contenant les grilles dans un dessiccateur pendant la nuit pour les faire sécher avant l'observation en MET.
   8. Consulter l'installation de microscopie de l'établissement concernant l'observation des grilles préparées. Certaines installations autorisent la formation des utilisateurs à l'utilisation de leurs instruments. Les détails spécifiques relatifs à la configuration et à l'observation d'un microscope particulier dépassent le cadre de cet article.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Préparation des échantillons pour la microscopie électronique en transmission
Grilles en nickel pour microscopie électronique avec film de support en carbone	Ladd Research	10880-100
Pincettes auto-fermantes inversées pour microscopie électronique	Ted Pella	5372-NM
Papier filtre qualitatif	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Boîtes de Pétri en verre	Sigma-Aldrich	BR455743
Solution mère de HEPES à 100 mM (pH 7,2)	N/A	N/A
Acétate d'urane à 2 %	N/A	N/A