Délivrance de gènes médiée par des bactériophages chez les bactéries spirochètes

Résumé

Source : Eggers, C. H. Manipulation génétique médiée par des bactériophages du spirochète de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).

Ce vidéo montre la transduction de spirochètes Borrelia génétiquement modifiés à l'aide de bactériophages non infectieux, précipités par le polyéthylène glycol, portant un plasmide de résistance à la kanamycine. Après incubation avec les bactéries, la culture est ensemencée sur un milieu enrichi en antibiotique. Seules les cellules ayant intégré le plasmide survivent et forment des colonies. Ces colonies sont ensuite sélectionnées et mises en culture dans un milieu liquide contenant l'antibiotique afin d'obtenir une population bactérienne stable porteuse du plasmide, destinée à des applications ultérieures.

Protocole

1. Essai de transduction après précipitation au PEG (polyéthylène glycol) du bactériophage φBB-1

1. Préparer B. burgdorferi cultures devant être utilisées comme récipiennes dans les essais de transduction. En fonction de la densité déterminée, calculer le volume de culture récipientien nécessaire pour obtenir 15 mL de 1 × 107 spirochètes·mL−1
2. Centrifuger le volume de culture à 6 000 x g pendant 10 min. Décanter le surnageant et resuspendre le culot dans 14,5 mL de BSK (Barbour-Stoenner-Kelly) frais.
3. Ajouter ≤500 µL d'ajouter l'échantillon de phage précipité par le PEG à la culture du clone récepteur. Bien mélanger et incuber à 33 °C pendant 72 à 96 h.
   REMARQUE : La quantité de phage récupérée lors de la précipitation au PEG peut varier, selon plusieurs facteurs. Toutefois, à partir d'une culture de 15 mL induite B. burgdorferi souche CA-11.2A, 500 µL contient généralement entre 50 et 1 000 phages viables²⁸. Des volumes de récupération de phages ≥500 µL affecter négativement B. burgdorferi croissance, probablement en raison de l'augmentation du rapport entre le milieu de suspension (SM) et le BSK.
4. Effectuer la sélection des transductants par étalage en phase solide après mélange avec le bactériophage précipité à l'aide de PEG.

2. Sélection des transductants

REMARQUE : La mise en place sur phase solide des transductants potentiels est réalisée à l’aide d’une modification en couche unique du protocole. Les colonies de B. burgdorferi se développent à l’intérieur de l’agar ; par conséquent, pour la sélection des transductants par mise en place sur phase solide, les échantillons doivent être ajoutés au milieu au moment de la coulée des boîtes. Cette technique pourrait également être efficace pour la sélection des transductants, mais n’a pas encore été testée à cette fin.

1. Déterminer le nombre de plaques nécessaires pour la sélection des transductants en fonction du nombre d'échantillons provenant des tests de transduction et des témoins à ensemencer.
   REMARQUE : Généralement, deux boîtes sont coulées par échantillon : l'une correspondant à environ 10 % du volume de la culture, et l'autre incluant le reste de la culture. En outre, coulez des boîtes servant de témoins négatifs afin de tester individuellement que la préparation de phages et/ou les clones parents utilisés comme donneurs et receveurs ne croissent pas en présence de l'antibiotique(s) utilisé(s) lors de la sélection. Il est également recommandé de préparer du milieu de coulée pour au moins deux boîtes supplémentaires. Par exemple, si le nombre d'échantillons et de témoins à ensemencer est de huit, préparez suffisamment de mélange de coulée pour 10 boîtes.
2. Préparer les solutions pour la mise en culture comme décrit ci-dessous.
   REMARQUE : Chaque plaque contiendra 30 mL, composés de 20 mL de BSK 1,5x pour la mise en plaque et de 10 mL d'agarose à 2,1 % (rapport 2:1). Ceci permet d'obtenir une plaque avec des concentrations finales de BSK 1x et d'agarose à 0,7 %. Par exemple, pour 10 plaques, préparer un mélange total de 300 mL composé de 200 mL de BSK 1,5x et de 100 mL d'agarose à 2,1 %.
   1. Préparer 1 L de BSK 1,5x en utilisant les quantités de chaque composant indiquées pour le BSK 1,5x. Conserver comme décrit pour le BSK 1x.
   2. Préparer de l'agarose à 2,1 % dans de l'eau et stériliser à l'autoclave. Utiliser la solution d'agarose fraîchement préparée ou la conserver à température ambiante. Si elle est conservée à température ambiante, la chauffer au four à micro-ondes avec le couvercle légèrement desserré jusqu'à complète fusion avant l'ensemencement.
   3. Déterminer le volume d'antibiotique(s) nécessaire pour atteindre la concentration appropriée en fonction du mélange total destiné à la mise en boîte.
      REMARQUE : Si le volume total de la solution finale pour l’étalage est de 300 mL, mélanger 200 mL de BSK 1,5x et une quantité suffisante d’antibiotique pour que les 300 mL entiers contiennent la concentration finale correcte d’antibiotique. Si le donneur et le receveur dans le test de transduction possèdent des gènes de résistance à des antibiotiques différents, le mélange d’étalage doit contenir les deux antibiotiques. Si le bactériophage précipité par le PEG à partir du donneur code un marqueur de résistance à un antibiotique et que le receveur n’en possède aucun, le mélange d’étalage doit contenir uniquement cet antibiotique.
3. En fonction du nombre de boîtes à verser, transférer la quantité appropriée de BSK 1,5x et d'antibiotique(s) dans un flacon stérile suffisamment grand pour contenir l'ensemble du mélange de coulée. Équilibrer dans un bain-marie à 56 °C pendant ≥15 min.
4. Équilibrer l'agarose en fusion provenant de l'autoclave ou du micro-ondes dans un 56 °C bain-marie pendant ≥15 min.
5. Après l'équilibration, ajouter la quantité déterminée d'agarose à 2,1 % dans la bouteille contenant le BSK 1,5x (avec antibiotique) et remettre la solution de coulée au bain-marie à 42 °C pendant 10 à 15 min.
   REMARQUE : Des températures plus élevées peuvent endommager ou tuer les spirochètes³⁶. Si l'on utilise le même bain-marie que précédemment, refroidir le bain-marie à 42-45 °C avant de démarrer le chronomètre pour l'équilibration. Ne laissez pas la solution de mise en place équilibrer à 42 °C pendant plus de 20 min, sinon il commencera à durcir lors de la coulée des géloses.
6. Pendant l'équilibration, préparez le B. burgdorferi échantillons à étaler. Transférer la quantité à étaler dans un tube conique stérile de 50 mL pour centrifugeuse
7. Si l'on prélève une quantité inférieure à 1,5 mL (<5 % du volume final de la plaque de 30 mL), transférer l'échantillon dans le nouveau tube et ajouter directement le mélange de culture à l'échantillon lors de l'ensemencement.
   1. Pour des volumes plus importants, transférer le volume souhaité de culture dans un nouveau tube, puis centrifuger à 6 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Décanter tout le surnageant sauf 100-500 µL du surnageant et utilisez le reste pour resuspendre complètement le culot avant l'ensemencement.
   2. Pour les plaques de contrôle après co-culture, ajouter ≥107 cellules des clones donneurs ou receveurs dans des tubes coniques stériles de 50 mL. Si le volume dépasse 1,5 mL, centrifuger et reprendre le culot. Si un essai de transduction a été réalisé à l’aide du bactériophage précipité par PEG, en plus du clone receveur, ajouter 100-250 µL du prélèvement de bactériophages dans un tube conique stérile de 50 mL pour ensemencement.
8. Après que la solution de mise en plaque a été équilibrée à 42-45 °C pendant 10 à 15 min, transférer 30 mL de la solution d'ensemencement dans un tube contenant l'échantillon approprié ; distribuer immédiatement le mélange d'ensemencement et l'échantillon dans une boîte étiquetée. Répéter l'opération avec une pipette neuve pour chaque échantillon à ensemencer.
9. Laisser les boîtes refroidir pendant 15 à 20 min, puis les placer dans un 33 °C incubateur supplémenté avec 5 % de CO₂₂. Ne pas retourner les boîtes de Pétri pendant au moins 48 heures après leur préparation.
10. Selon le fond génétique du clone récepteur, vérifier que les colonies apparaissent dans l'agarose des boîtes de sélection après 10 à 21 jours d'incubation. Prélever au moins 5 à 10 colonies qui se développent sur la boîte en présence des deux antibiotiques à l’aide d’une pipette en borosilicate stérile de 5,75 pouces munie d’un embout en coton et les inoculer dans 1,5 mL de BSK 1x contenant l’(les) antibiotique(s) approprié(s).
11. Faire croître les colonies inoculées à 33 °C pendant 3 à 5 jours ou jusqu'à ce qu'ils atteignent une densité d'environ 20 à 40 spirochètes par champ à un grossissement de 200x en microscopie en champ sombre.
    REMARQUE : Une fois sélectionnés, les spirochètes peuvent être congelés pour un stockage à long terme à −80 °C en mélangeant un volume égal de culture avec un mélange de 60 % de glycérol et de 40 % de BSK 1x stérilisé par filtration à travers un 0.22 µm filtre

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes coniques de centrifugation de 15 mL (polypropylène)	USA Scientific	5618-8271
Mitomycine C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	ATTENTION : cancérogène potentiel ; utiliser uniquement sous hotte de sécurité chimique
Pipettes Pasteur de 5,75 pouces (avec bourre de coton/en verre borosilicaté/non stériles)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Stériliser à l'autoclave avant utilisation
Tubes coniques de centrifugation de 50 mL (polypropylène)	USA Scientific	1500-1211
Éthanol absolu
Érythromycine	Research Products International Corp	E57000-25.0
Solution réactif de gentamicine	Gibco	15750-060
Glucose (dextrose anhydre)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Sulfate de kanamycine	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0