Transfert de gènes dans des organoïdes intestinaux de souris à l'aide de vecteurs lentiviraux

Résumé

Source : Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocole de transduction lentivirale et d'analyse en aval d'organoïdes intestinaux. J. Vis. Exp. (2015)

Ce vidéo décrit la transduction lentivirale d'organoides intestinaux de souris à partir d'une structure semblable à un crypte contenant une suspension. En utilisant une matrice de membrane basale comme support et des milieux enrichis en facteurs de croissance, des vecteurs lentiviraux sont introduits afin de permettre une intégration génique stable

Protocole

Transduction lentivirale d'organoïdes

Jour 0 :

1. Scinder une puits complet de 0,95 cm² d'organoïdes deux jours avant la transduction dans un nouveau puits, en visant à obtenir environ 50 petits organoïdes. Scinder les organoïdes (Figure 1A, B).
2. Supplémenter le milieu de culture d'organoïdes avec 10 µM de Chir99021 et 10 mM de nicotinamide pour obtenir des cryptes kystiques hyperprolifératives (Figure 1C).
   REMARQUE : Les cryptes kystiques se développeront au mieux lorsque les organoïdes fraîchement scindés sont cultivés en présence de Chir99021.

Jour 2 :

3. Récupérez les organoïdes en aspirant et expulsant plusieurs fois le Matrigel et le milieu à l’aide d’une micropipette p1000, perturbant ainsi le mélange. Placez le mélange dans un tube de 15 mL.
4. Poursuivez la disruption à l’aide d’une pipette Pasteur dont l’ouverture distale a été réduite par fusion. Centrifugez les organoïdes pour former un culot pendant 5 min à 100 x g.
   REMARQUE : En fonction de la taille de la centrifugeuse, utilisez une vitesse différente. Il est nécessaire de déterminer la vitesse exacte permettant de séparer les organoïdes disruptés du mélange.
5. Éliminez le surnageant et ajoutez 500 µL de trypsine 1x préalablement réchauffée (équivalente à une trypsine à 0,25 %). Remettez les organoïdes en suspension dans la trypsine et incubez pendant 3 min dans un bain-marie à 37 °C.
6. Inhibez l’activité de la trypsine en ajoutant 3,5 mL de milieu de culture pour lignée cellulaire [milieu de Dulbecco (DMEM) complété avec 10 % de sérum de veau fœtal (FCS), 1 % de pénicilline/streptomycine et du glutamine]. Centrifugez pendant 5 min à 500 x g.
7. Éliminez le surnageant de manière à conserver un culot dans environ 20 µL de milieu. Transférez les organoïdes, dans cette petite quantité résiduelle de milieu, dans un puits d’une plaque de 48 puits.
8. Ajoutez du lentivirus à haut titre dans le milieu de transduction, remettez en suspension et passez à l’étape 3.10. En cas de faible efficacité de transduction.
   REMARQUE : Pour une transduction efficace, ajoutez généralement un aliquot de 250 µL de lentivirus à haut titre par puits d’organoïdes. Cela représente 50 % de l’ensemble du lentivirus récolté lors d’une production unique.
9. Optionnellement : pour améliorer l’efficacité de transduction, effectuez une spinoculation en plaçant la plaque de 48 puits contenant les organoïdes dans une centrifugeuse préalablement réchauffée à 32 °C, puis faites tourner à 600 x g pendant 1 heure.
10. Placez le mélange organoïde-virus dans l’incubateur de culture et incubez pendant 1 heure à 37 °C dans l’incubateur afin de permettre la transduction.
11. Optionnellement : pour améliorer davantage l’efficacité de transduction, incubez les organoïdes pendant 3 heures supplémentaires à 37 °C dans l’incubateur de culture.
12. Ajoutez 1 mL de milieu de culture d’organoïdes, remettez le mélange organoïde-virus en suspension, transférez dans un tube microcentrifuge et centrifugez dans un microcentrifugeur pendant 5 min à 850 x g afin de former un culot d’organoïdes.
13. Éliminez le surnageant et remettez le culot en suspension dans 20 µL de Matrigel glacé. Étant donné que ce matériau durcit lorsqu’il s’échauffe, utilisez des embouts de pipette refroidis en aspirant et expulsant plusieurs fois du PBS glacé.
14. Déposez la goutte au centre d’un puits d’une plaque de 48 puits et incubez dans l’incubateur de culture à 37 °C pendant 15 min pour solidification.
15. Après 15 min, ajoutez soigneusement 250 µL de milieu de culture d’organoïdes supplémenté avec 10 mM de nicotinamide, 10 µM de Chir99021 et 10 µM de Y27632. De petits fragments d’organoïdes disruptés formeront de petits organoïdes kystiques dans les 24 heures.

Jour 5 :

16. Renouvelez le milieu et suppléez-le avec un antibiotique de sélection (pour la puromycine, utilisez 4 µg/mL).

Jour 7 :

1. Remplacer le milieu par un milieu de culture d'organoides standard, supplémenté d'un antibiotique de sélection.
   REMARQUE : La bourgeonnement sera complet 2 à 3 semaines après le retrait de Chir99021. Après la sélection, les organoides peuvent être cultivés sans antibiotiques de sélection.

Résultats

Figure 1 : Schéma de production du lentivirus pour la transduction d'organoïdes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Imine de polyéthylène	Polysciences	23966-2
Milieu DMEM	Lonza	BE12-614F
Sérum de veau fœtal	Lonza	DE14-801F
Pénicilline-streptomycine	Invitrogen	15140-122
Glutamine	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
DMEM-F12 avancé	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acétyl cystéine	Sigma	A9165-1G
EGF murin	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
Glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
Polybrene	Sigma	107689
Nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsine	Lonza	BE02-007E