Détection de l'activation de la voie SMAD par transduction par double adénovirus

Résumé

Source : Chen, H., et al.. Imagerie de cellules vivantes du TGF-β/voie de signalisation Smad3 in vitro et in vivo à l'aide d'un système rapporteur à adénovirus J. Vis. Exp. (2018).

Ce vidéo montre une méthode pour étudier l'activation de la voie de signalisation SMAD dans des cellules cancéreuses du sein à l'aide d'une double infection par adénovirus. Un virus délivre un gène GFP exprimé de façon constitutive, tandis que l'autre transporte un rapporteur RFP sous un promoteur sensible à SMAD. Après stimulation par le TGF-bêta, les protéines SMAD sont activées et forment un complexe qui induit l'expression de RFP. La détection de deux signaux dans des cellules vivantes confirme l'activation de la voie de signalisation.

Protocole

1. Transduction par double adénovirus dans des cellules individuelles vivantes

1. Ensemencer 1,0 - 1,5 x 10⁵ cellules MDA-MB-231 avec 500 μL de milieu de culture au Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) contenant 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans chaque puits d'une plaque de 12 puits (confluence cellulaire de 35 %, 2 puits au total).
2. Infecter les cellules avec 75 μL de vecteur adénoviral Ad-CMV-GFP (titre = 5 x 10⁹ PFU/mL) et 7,5 μL de vecteur adénoviral Ad-CAGA12-Td-Tom (titre = 5 x 10¹⁰ PFU/mL) afin d'obtenir une multiplicité d'infection (MOI) de 2 500, ce qui permet d'atteindre une positivité d'infection de 100 %.
3. Traiter les cellules avec ou sans 0,25 μL de facteur de croissance transformant bêta (TGF-β) par puits (10 mg/mL en stock, 5 ng/μL en concentration finale) immédiatement après l'infection par l'adénovirus.
4. Placer la plaque dans l'incubateur à 37 °C avec 10 % de CO₂ pendant 24 h.
5. Imager les cellules vivantes à l'aide d'un microscope à fluorescence en contraste de phase. Exciter la protéine verte fluorescente (GFP) à 470 nm et la protéine Td-Tomato à 554 nm.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	ThermoFisher	1881024	Chauffer au bain-marie à 37 °C avant utilisation
Sérum de veau foetal	Scientifix Life	FBS500-S	Inactiver par la chaleur avant utilisation
TGF-β1 humain recombinant	PEPROTECH	100-21	Prélever en aliquotes dans de l'eau distillée pour obtenir une concentration finale de 10 mg/mL
Microscopie à contraste de phase et en fluorescence	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
Solution			Composition
FBS-DMEM			5 % FBS inactivé par la chaleur ; 10 μg/mL de pénicilline ; 100 μg/mL de streptomycine