Imagerie par fluorescence multiplexée des acides nucléiques et des protéines virales dans des lymphocytes humains infectés

Résumé

Source : Shah, R., et al. Imagerie multiplexée par fluorescence à l'échelle de la cellule unique pour visualiser les acides nucléiques et les protéines viraux et suivre l'infection par le VIH, le HTLV, le VHB, le VHC, le virus Zika et la grippe. J. Vis. Exp. (2020)

Ce vidéo montre la visualisation simultanée de l'ADN, de l'ARN et de la protéine de capside du VIH-1 dans des lymphocytes humains infectés à l'aide de l'hybridation d'ADN ramifié et de l'immunofluorescence, permettant une analyse détaillée des stades de réplication virale au sein de cellules individuelles.

Protocole

1. Immunomarquage des protéines : pour marquer la ou les protéines d'intérêt

1. Décantation du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) et ajout de 200 µL de tampon de blocage (1 % p/v de BSA (albumine sérique bovine), 10 % v/v de FBS (sérum de veau fœtal) dans du PBS contenant 0,1 % v/v de Tween-20 (PBST)) sur la lamelle. Incuber 1 h à la température ambiante (TA).
2. Décantation du tampon de blocage et ajout de 200 µL d'anticorps primaire dilué dans du PBST + 1 % p/v de BSA. Incuber 1 h à la température ambiante.
3. Laver la lame deux fois avec du PBST pendant 10 min à la température ambiante sous agitation.
4. Ajouter un anticorps secondaire au choix pendant 1 h à la température ambiante dans du PBST + 1 % p/v de BSA.
5. Laver la lame avec du PBST pendant 10 min à la température ambiante sous agitation.

2. Coloration nucléaire : contre-colorer les noyaux après l'immunomarquage

1. Versez délicatement le PBST et ajoutez du DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) ou un colorant nucléaire au choix pendant 1 min à température ambiante.
2. Lavez la lame deux fois avec du PBS pendant 10 min à température ambiante sous agitation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-NS5a du VHC	Abcam	ab13833	Monoclonal de souris ; fonctionne avec les génotypes 1a, 1b, 3 et 4 du VHC
Anticorps monoclonal anti-p24 du VIH-1	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anticorps anti-Mov10	Abcam	ab80613	Polyclonal de lapin
Albumine sérique bovine			Réactif de blocage pour l'immunomarquage
Milieu cellulaire avec suppléments			Milieu adapté au modèle cellulaire
Lames couvre-objets
DAPI	ACD Bio		Colorant nucléaire (kit RNAscope d'ACD Bio)
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS 1X)	Gibco	14190250	Sans calcium ni magnésium
Sérum bovin fœtal (FBS)			Utiliser un FBS spécifique selon le sérum dans lequel l'anticorps secondaire a été produit (par exemple, FBS de chèvre)
Lames microscopiques Fisherbrand Colorfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Prénettoyées
Lames
Tween-20			Pour le tampon d'hybridation d'ADN et le PBS-T