Purification des intasomes du Prototype Foamy Virus par chromatographie d'exclusion stérique

Résumé

Source : Mackler, R. M., et al. Assemblage et purification des intasomes du virus foamy prototype. J. Vis. Exp. (2018)

Ce vidéo montre la purification des intasomes du virus foamy prototype (PFV) à partir d'une suspension mixte protéine-ADN en utilisant une extraction saline et une chromatographie d'exclusion stérique, produisant des complexes actifs destinés à des analyses ultérieures.

Protocole

1. Solubilisation de l'intasome

1. Préparez deux pointes de pipette à grand orifice en retirant 2 à 4 mm de l'extrémité d'une pointe de 200 µL à l'aide d'un rasoir ou d'une lame de scalpel neuf sur une surface propre.
   REMARQUE : Les pointes seront utilisées aux étapes 1.3 et 1.5.
2. Retirez le tube de dialyse du tampon de dialyse. Afin d'éviter une dilution de l'échantillon d'intasome par le tampon de dialyse pouvant rester à l'extrémité du tube près du clip, utilisez une micropipette équipée d'une petite pointe pour éliminer tout excès de tampon de dialyse. Retirez le clip d'une extrémité du tube de dialyse.
3. Utilisez une pointe de pipette à grand orifice de l'étape 1.1 pour transférer l'échantillon, y compris le précipité contenu dans le tube de dialyse, dans un tube de 1,5 mL placé sur de la glace. 
   REMARQUE : Le volume total du matériau récupéré est généralement d'environ ~140 µL.
4. L'échantillon contenant le précipité est à 200 mM NaCl ; augmentez la concentration en sel jusqu'à une concentration finale de 320 mM NaCl en ajoutant le volume approprié d'une solution mère de NaCl à 5 M. Par exemple, pour un échantillon de 150 µL, ajoutez 3,9 µL de NaCl à 5 M et 1,1 µL de ddH₂O pour un volume final de 155 µL. Transférez le seau contenant la glace et l'échantillon dans une chambre froide à 4 ˚C.
5. Utilisez une pointe de pipette à grand orifice de l'étape 1.1 pour resuspendre et solubiliser le précipité par pipetage. Répétez toutes les 20 minutes pendant au moins 1 heure. Observez que la majeure partie du précipité doit passer en solution.
   REMARQUE : Le pipetage destiné à resuspendre le précipité peut être interrompu lorsque l'on constate que la réduction du précipité n'est plus nettement perceptible entre deux points temporels. Lorsque l'ADN viral (vDNA) n'est pas marqué ou est marqué en interne, le précipité est réduit d'environ ~90 % selon l'inspection visuelle. Dans le cas du vDNA marqué en extrémité avec Cy5, le précipité est réduit d'environ seulement ~20 % ; la majeure partie du précipité contenant du vDNA marqué en extrémité avec un fluorophore ne se solubilisera pas. La quantité de précipité effectivement solubilisée est variable et doit être déterminée empiriquement.

2. Purification de l'Intasome

1. Préparer 250 mL de tampon de chromatographie d'exclusion stérique (SEC) (20 mM Bis-tris propane, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10 % de glycérol). Filtrer stérilement le tampon à l’aide d’un filtre de 0,2 µm et conserver à 4 ˚C.
   REMARQUE : Toutes les étapes de purification sont effectuées dans une chambre froide à 4 ˚C.
2. Équilibrer une colonne SEC en agarose réticulée (diamètre = 10 mm ; longueur = 300 mm ; volume de lit = 24 mL ; volume d’échantillon = 25 - 500 µL ; pression maximale = 1,5 MPa ; limite d’exclusion = 4 x 10⁷ Da ; sépare les masses moléculaires comprises entre 5 et 5 000 kDa, voir le tableau des matériaux) avec le tampon SEC à un débit de 0,4 mL/min.
   REMARQUE : Cette purification peut être adaptée à différentes colonnes d’exclusion stérique si elles sont capables de séparer efficacement 300 kDa de 44 kDa, comme Superose 12 10/300 GL ou Superose 6 Increase. Superose 12 10/300 GL présente une résolution plus faible, entraînant un chevauchement plus important des pics. Inversement, Superose 6 Increase offre une résolution plus élevée et une meilleure séparation.
3. Centrifuger l’échantillon d’intasome dans une microcentrifugeuse à 14 000 x g pendant 10 min à 4 ˚C afin de former un culot avec tout précipité résiduel. Retirer soigneusement le surnageant. Charger le surnageant sur une boucle d’injection de 200 µL (tuyau pouvant contenir environ 200 µL). Appliquer l’échantillon sur la colonne SEC.
   REMARQUE : Des volumes de charge plus faibles permettent une meilleure résolution par SEC.
4. Éluer avec 25 mL de tampon SEC et recueillir 95 fractions de 270 µL. Observer que le chromatogramme SEC présente trois pics A₂₈₀/A₂₆₀ (Figure 1).
   REMARQUE : Le premier pic correspond à un agrégat (~9,0 - 11,5 mL d’élution), suivi du pic de l’intasome tétramère de PFV (~12,0 - 14,75 mL d’élution) et du pic du monomère d’IN de PFV avec l’ADN viral libre (~15,0 - 18,0 mL d’élution).

Résultats

Figure 1 : Chromatogramme de filtration sur gel. Un assemblage d'intégrasome de PFV a été séparé à l'aide d'une colonne de filtration sur gel en agarose. Cette colonne permet de séparer l'agrégat (1), l'intégrasome de PFV composé d'un tétramère d'IN de PFV et de deux ADNv (2), ainsi que l'IN monomérique de PFV et l'ADNv (3). Cet exemple incluait un ADNv marqué par un fluorophore Cy5 en position interne, détecté par excitation à 650 nm. L'axe des ordonnées indique la densité optique (DO) en unités de milli-absorbance (mAU).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Oligomères d'ADN	IDT	N/A	Oligos d'ADN sur mesure
NaCl	P212121	RP-S23020
BIS-TRIS propane, >=99,0 % (titrage)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
Glycérol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Pointes de chargement de gel, 1 - 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
Lame de rasoir ; à arête unique ; 100/Pk. ; paquet de 100	Fisher Scientific	12-640
Pinces pour tubulure de dialyse	Spectrum Labs	132734
Tubulure de dialyse 6-8 kDa, 10 mm	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201