Obtention de l'ARN viral pour l'analyse par réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel (qPCR)

Résumé

Source : Suzuki, Y., et al. Mesurer l'ARN du virus de la dengue dans le surnageant de culture de cellules infectées par réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel. J. Vis. Exp. (2018).

Ce vidéo montre la procédure de préparation d'échantillons viraux pour l'analyse par PCR quantitative (réaction en chaîne par polymérase). Les échantillons viraux et les standards d'ARN sont dilués en série, traités avec un tampon de protéinase K, puis incubés à température contrôlée afin de libérer l'ARN. L'ARN ainsi traité est ensuite stabilisé et conservé en vue de la quantification des niveaux d'ARN viral.

Protocole

1. Traitement des échantillons viraux pour la RT-qPCR (réaction de polymérisation en chaîne en temps réel quantitative)

REMARQUE : Les étapes 1.1 à 1.3 doivent être effectuées à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique. En particulier, la manipulation du surnageant de culture contenant un virus infectieux doit être réalisée dans un environnement de niveau de sécurité biologique 2 (ou supérieur).

1. Mélanger 199 µL d’un tampon de traitement et 1 µL de protéinase K sans nucléase.
2. Diluer en série l'ARN synthétisé de la région 3’UTR (région non traduite) du virus de la dengue (DENV) à un ratio de 1:10 afin d'obtenir un étalon d'ARN compris entre 5 x 10⁹ et 5 x 10³ copies/µL, en utilisant un milieu de culture cellulaire (par exemple, DMEM (milieu d’Eagle modifié de Dulbecco) complété avec 10 % de sérum de veau fœtal et des antibiotiques [DMEM/10 % de sérum de veau fœtal]) contenant 40 unités/mL d'inhibiteur de RNase.
3. Mélanger 5 µL du surnageant de culture de cellules infectées par le DENV et l'étalon d'ARN 3’UTR du DENV avec 5 µL de solution de tampon de traitement/protéinase K, en utilisant des bandes PCR à 8 tubes ou une plaque PCR à 96 puits. En tant que témoin sans matrice (NTC), mélanger 5 µL de milieu de culture cellulaire (c’est-à-dire sans virus) avec 5 µL de la solution de tampon de traitement/protéinase K.
4. Après une courte centrifugation, incuber les échantillons dans un thermocycleur selon les conditions suivantes : 1 cycle (25 °C pendant 10 min et 75 °C pendant 5 min).
REMARQUE : Les échantillons traités peuvent être conservés à 4 °C si l'analyse par PCR en temps réel est effectuée le même jour. Pour une conservation à long terme, les échantillons doivent être stockés à -80 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	Un instrument thermocycleur comparable peut être utilisé, mais les conditions du cycle PCR doivent être optimisées.
Inhibiteur d'ARNase recombinant	Takara Bio. Inc	2313A	40 unités/μL
Kit RNeasy Mini	Qiagen	74104	Un kit de purification ARN comparable peut être utilisé.
Protéinase K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 unités/mL. Un réactif comparable peut être utilisé.
Plaque de réaction MicroAmp Fast Optical 96 puits, 0,1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	Une plaque ou un tube comparable peut être utilisé selon l'appareil de PCR en temps réel, mais les conditions du cycle PCR doivent être optimisées.