Récolte de particules du virus de l'hépatite E à partir de cellules de cancer du foie humain

Résumé

Source : Meister, T. L., et al. Un modèle de culture cellulaire pour la production de stocks de virus de l'hépatite E à forte titrage. J. Vis. Exp. (2020).

Ce vidéo montre le processus d'isolement de particules du virus de l'hépatite E (HEV) à partir de cellules de carcinome hépatocellulaire humain transfectées. Les particules virales extracellulaires sont recueillies à partir de surnageants filtrés, tandis que les particules intracellulaires sont libérées en soumettant les cellules à des cycles répétés de congélation-dégel. Le lysat est centrifugé, et le surnageant contenant les particules de HEV est aliquoté et stocké à une température ultra-basse en vue d'une utilisation ultérieure

Protocole

1. Préparation des cellules HepG2 pour la production de virus de l'hépatite E dérivé de cultures cellulaires (HEVcc)
REMARQUE : Pour éviter toute contamination, la préparation des cellules, l'électroporation, l'infection, la récolte et la fixation des cellules ont été réalisées dans des conditions stériles dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2. Les étapes d'incubation à 37 °C impliquant les cellules ont été effectuées dans un incubateur à 5 % de CO₂.

1. Pour préparer les cellules HepG2 en vue de la production de HEVcc (Figure 1), ensemencer les cellules dans un milieu de culture complet de Dulbecco (DMEM) (voir Tableau 1) sur une plaque de culture de 15 cm revêtue de collagène (voir Tableau 1, filtrer à l’aide d’un tamis de 0,2 µm une solution tampon phosphate (PBS) stérile acidifiée à l’acide acétique avant d’ajouter le collagène). Incuber à 37 °C jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 90 %.
   REMARQUE : chaque plaque de 15 cm contenant des cellules à 90 % confluentes permettra d’obtenir suffisamment de cellules pour jusqu’à 4 électroporations.
2. Retirer délicatement le milieu de la plaque et laver les cellules une fois avec 10 mL de PBS 1x. Détacher les cellules par trypsination en ajoutant 3 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % sur les cellules, puis incuber à 37 °C jusqu’à détachement complet. Resuspendre les cellules dans 10 mL de milieu DMEM complet et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL. Déterminer le nombre total de cellules.
3. Étant donné que chaque électroporation nécessite 5 x 10⁶ cellules, transférer le volume approprié dans un nouveau tube de 50 mL et compléter à au moins 35 mL avec du PBS 1x. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min, puis jeter soigneusement le surnageant sans perturber le culot cellulaire.
4. Laver à nouveau les cellules une fois avec 35 mL de PBS 1x à 200 x g pendant 5 min. Placer les cellules sur de la glace et ne pas encore retirer le PBS 1x afin de maintenir les cellules en suspension.

2. Électroporation des cellules HepG2

1. Pour l'électroporation des cellules HepG2 (Figure 2), préparer 400 µL de Cytomix complet par électroporation en complétant 384 µL de Cytomix (voir Tableau 1) avec 2 mM d'ATP et 5 mM de glutathion. Préparer frais juste avant utilisation et placer immédiatement sur de la glace.
   REMARQUE : Une exécution correcte et rapide des étapes suivantes est cruciale. Veiller donc à ce que tout soit correctement préparé.
2. Retirer soigneusement 1x PBS sans perturber le culot cellulaire de l'étape 4.4. Resuspendre 5 x 10⁶ cellules dans 400 µL de Cytomix complet et ajouter 5 µg d'ARN. Transférer la solution dans une cuvette de 4 mm et appliquer une impulsion unique de 975 µF, 270 V pendant 20 ms à l’aide d’un système d’électroporation.
   1. Après électroporation, transférer les cellules le plus rapidement possible à l’aide d’une pipette Pasteur dans 11 mL de DMEM complet par électroporation.
      REMARQUE : Afin de s’assurer que l’ARN est correctement transféré dans les cellules HepG2, un contrôle de transfection (CT) sera effectué. Les taux de transfection attendus varient entre 40 et 60 % de cellules positives pour ORF2.
3. Transférer 10 mL de cellules électroporées dans une boîte de culture de 10 cm revêtue de collagène. Ajouter 1,3 x 10⁵ cellules électroporées (300 µL) dans une cavité d’une plaque de microtitration 24 puits revêtue de collagène contenant un lamelle (utilisée ultérieurement comme contrôle de transfection). Répartir les cellules uniformément et incuber à 37 °C.
   1. Après 24 h, changer le milieu dans la boîte de 10 cm et le remplacer par 10 mL de DMEM complet frais. Ne pas changer le milieu du contrôle de transfection. Incuber pendant 6 jours supplémentaires à 37 °C.

3. Récupération des particules de VHE dérivées de cultures cellulaires intracellulaires et extracellulaires (VHEcc)

1. Pour récolter les HEVcc extracellulaires (Figure 3), filtrer le surnageant obtenu à partir de la boîte de 10 cm après 6 jours à travers une membrane de 0,45 µm afin d'éliminer tous les débris cellulaires. Conserver les HEVcc extracellulaires récoltés à 4 °C pour une infection le jour même ; sinon, les stocker à -80 °C.
2. Pour récolter les HEVcc intracellulaires (Figure 3), laver les cellules avec du PBS 1x et les trypsiner en ajoutant 1,5 mL de trypsine-éthylènediaminetétraacétique (trypsine-EDTA) à 0,05 %. Incuber à 37 °C jusqu'à ce que les cellules soient complètement détachées. Ajouter 10 mL de DMEM complet, rincer la plaque pour détacher les cellules et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL. Laver les cellules deux fois avec du PBS. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
   1. Jeter le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 1,6 mL de DMEM complet par électroporation. Transférer la suspension cellulaire dans un tube réaction de 2 mL.
      REMARQUE : Ne pas utiliser de volumes supérieurs, car cela diminuerait fortement la charge virale.
   2. Congeler (dans de l'azote liquide) et décongeler les cellules. Répéter cette séquence 3 fois.
      REMARQUE : Ne pas regrouper plus d'une électroporation (1,6 mL) pour les 3 cycles de congélation-décongélation, car l'efficacité de lyse serait compromise. Ne pas vortexer la suspension cellulaire entre les cycles. Veiller à décongeler lentement la suspension cellulaire (par exemple, à température ambiante ou sur glace) afin de maximiser la charge virale.
   3. Centrifuger à grande vitesse les cellules lysées pendant 10 min à 10 000 x g pour séparer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Utiliser le surnageant pour l'infection ; sinon, le stocker à -80 °C.
   4. Éventuellement, concentrer les HEVcc extracellulaires et intracellulaires à l'aide d'un concentrateur afin d'augmenter la charge virale.

Tableau 1 : Tableau des compositions des tampons.

Solution de travail	Concentration	Volume
Collagène	40 mL	PBS
	40 µl	Acide acétique
	1 mL	Solution de collagène R stérile à 0,4 %
Cytomix	120 mM	KCl
	0,15 mM	CaCl2
	10 mM	K2HPO4 (pH 7,4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
DMEM complet	500 mL	DMEM
	5 mL	Pen/Strep
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutamine
	50 mL	Sérum de veau fœtal
MEM complet	500 mL	MEM
	5 mL	Pyruvate de sodium
	5 mL	Gentamicine
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutamine
	50 mL	ultra-low IgG

Résultats

Figure 1 : Schéma du montage expérimental pour la préparation des cellules HepG2 en vue de la production de virus de l'hépatite E dérivé de culture cellulaire (HEVcc).

Figure 2 : Schéma du dispositif expérimental pour l'électroporation des cellules HepG2.

Figure 3 : Schéma du dispositif expérimental pour la récolte de HEVcc intracellulaire et extracellulaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Maille 0,45 µm	Sarstedt	83.1826	Récupération du virus extracellulaire
MEM	gibco	31095-029	Culture cellulaire
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Culture cellulaire
Trypsine-EDTA (0,5 %)	gibco	15400054	Culture cellulaire
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Culture cellulaire
Acide acétique	CarlRoth	6755.1	Solution working de collagène
ATP	Roche	11140965001	Transcription in vitro et électroporation
BioRender	BioRender		Génération de figures
Chlorure de calcium	Roth	5239.2	Cytomix
Solution de collagène R stérile à 0,4 %	Serva	47256.01	Solution working de collagène
DMEM	gibco	41965-039	Culture cellulaire
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Électroporation
HEPES	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Di-phosphate de potassium	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
Phosphate de potassium dihydrogène	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamine	gibco	25030081	Culture cellulaire
Glutathion réduit	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Culture cellulaire
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Culture cellulaire
Chlorure de magnésium	Roth	2189.2	Cytomix
Spectrophotomètre microvolume UV-Vis NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Concentration d'ADN/ARN
PBS	gibco	70011051	Culture cellulaire
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Culture cellulaire