Reprogrammation de cellules sanguines humaines en cellules souches pluripotentes induites médiée par le virus Sendai

Résumé

Source : Rim, Y. A., et al. Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules sanguines à l'aide du virus de Sendai et de la centrifugation. J. Vis. Exp. (2016).

Ce vidéo montre la génération de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain, en utilisant un réprogrammation médiée par le virus de Sendai. Les facteurs de transcription viraux activent les réseaux de pluripotence et suppriment les gènes d'engagement lignéaire, permettant à un sous-ensemble de cellules d'acquérir des propriétés d'adhérence et de former des colonies d'iPSC. Le protocole enrichit et maintient ces cellules reprogrammées par une liaison sélective à la matrice et un renouvellement quotidien du milieu.

Protocole

Toutes les procédures impliquant la collecte d'échantillons ont été réalisées conformément aux lignes directrices du comité d'éthique (IRB) de l'institut.

1. Transduction par le virus Sendai

1. Transduction (jour 0)
   1. Recueillir et transférer les cellules sanguines dans un tube conique de 15 ml et les compter à l’aide d’un hémocytomètre.
   2. Préparer 3 x 10⁵ cellules par transduction et centrifuger les cellules à 515 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
   3. Éliminer le surnageant par aspiration et resuspendre les cellules dans 0,5 ml de milieu pour cellules sanguines.
   4. Transférer les cellules dans une cavité d’une plaque 24 puits non revêtue.
   5. Dégeler le mélange de virus de Sendai sur de la glace et l’ajouter aux cellules en suspension. Ajouter le virus de Sendai aux cellules selon les recommandations du fabricant.
   6. Fermer la plaque avec un film d’étanchéité et la centrifuger à 1 150 x g pendant 30 min à 30 °C.
   7. Après la centrifugation, incuber les cellules à 37 °C sous 5 % de CO₂ pendant la nuit (O/N).
2. Transfert des cellules vers la matrice d’alimentation (jour 1)
   1. Le lendemain, revêtir une plaque 24 puits de vitronectine. Diluer la solution de vitronectine dans du PBS pour obtenir une concentration finale de 5 µg/ml. Ajouter 1 ml de vitronectine dans une cavité d’une plaque 24 puits et incuber à température ambiante pendant au moins 1 heure. Retirer la solution de revêtement avant utilisation. Les plaques revêtues peuvent être conservées à température ambiante pendant 3 jours.
   2. Transférer tout le milieu contenant les cellules et le virus vers la cavité revêtue.
   3. Recueillir les cellules restantes avec 0,5 ml supplémentaire de milieu frais pour cellules sanguines et les ajouter à la cavité contenant les cellules.
   4. Centrifuger la plaque à 1 150 x g pendant 10 min à 35 °C.
   5. Après la centrifugation, éliminer le surnageant, ajouter 1 ml de milieu pour cellules iPSC et maintenir les cellules à 37 °C sous 5 % de CO₂ pendant la nuit (O/N).
3. Deuxième transfert cellulaire (jour 2)
   1. Revêtir les cavités d’une nouvelle plaque 24 puits avec de la vitronectine à 5 µg/ml, comme décrit à l’étape 1.2.1. Utiliser une cavité de la plaque par transduction.
   2. Transférer la suspension cellulaire depuis la première plaque vers la plaque de vitronectine nouvellement revêtue.
      REMARQUE : Si elles ne sont pas nécessaires, les cellules en suspension peuvent être éliminées. La procédure mentionnée à l’étape 2.3 peut être répétée 2 à 3 fois avec les cellules en suspension. Si les étapes sont répétées, récolter les cellules.
   3. Entre-temps, ajouter 1 ml de milieu pour cellules iPSC (cellules souches pluripotentes induites) dans la cavité de la première plaque, pour le maintien, et incuber à 37 °C sous 5 % de CO₂ pendant la nuit (O/N).
   4. Maintenir les cellules adhérentes à 37 °C et sous 5 % de CO₂ et effectuer un changement quotidien du milieu avec du milieu frais pour cellules iPSC. Des colonies apparaîtront entre les jours 14 et 21 après la transduction.
   5. Centrifuger la plaque nouvellement revêtue contenant les cellules en suspension à 1 150 x g et 35 °C pendant 10 min.
   6. Après la centrifugation, incuber les cellules à 37 °C sous 5 % de CO₂ pendant la nuit (O/N).
   7. Le lendemain, éliminer le surnageant et le remplacer par du milieu frais pour cellules iPSC.
      REMARQUE : La procédure mentionnée à l’étape 1.3 peut être répétée 2 à 3 fois avec les cellules en suspension. Si les étapes doivent être répétées, récolter les cellules présentes dans le surnageant et répéter l’étape 1.3.
   8. Maintenir les cellules adhérentes avec des changements quotidiens de milieu jusqu’à atteindre une confluence de 80 %.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Verrerie plastique
Tubes coniques de 50 ml	SPL	50050
Tubes coniques de 15 ml	SPL	50015
Pipette jetable de 10 ml	Falcon	7551
Pipette jetable de 5 ml	Falcon	7543
Plaque 12 puits	TPP	92012
Plaque 24 puits	TPP	92024
Matériaux pour la génération et la culture des iPSC
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	milieu pour iPSC
Vitronectine	Life Technologies	A14700
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Solution de détachement des colonies